第一论文网免费提供农学毕业论文论文范文,农学毕业论文论文格式模板下载

烟草PHOT2基因cDNA片段的克隆与RNAi表达载体的构建

  • 投稿剑圣
  • 更新时间2015-09-22
  • 阅读量405次
  • 评分4
  • 89
  • 0

乔新荣1,陈 琼1,郭桥燕2,徐长水3

(1.信阳农林学院,河南 信阳 464000;2.河南省烟草公司平顶山市公司,河南 平顶山 467000;3.河南大学生命科学学院/植物逆境生物学重点实验室,河南 开封 475004)

摘要:采用生物信息学方法,以番茄(Solanum lycopersicum)PHOT2基因序列为探针,比对了烟草(Nicotiana tabacum)EST数据库,并根据获得的同源性较高的EST序列设计引物,PCR扩增了烟草K326 PHOT2基因的cDNA片段。结果表明,成功扩增出了PHOT2基因的cDNA片段,并构建了干扰烟草PHOT2基因表达的RNAi表达载体。

教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 :烟草(Nicotiana tabacum);向光素;克隆;载体

中图分类号:Q781 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2015)04-0981-03

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.04.055

收稿日期:2014-08-08

作者简介:乔新荣(1972-),女,河南新密人,博士,讲师,主要从事植物生理及分子生物学研究,(电话)0376-6698023

(电子信箱)xinrong806@163.com。

光是调节植物生长发育的一个重要环境因子,植物中已分离了4种对不同波长光感知的受体,分别为光敏色素(Phytochrome, PHY)[1], 隐花色素(Cryptochrome,CRY)[2],向光素(Phototropin, PHOT)[3]和Zeitlupe蛋白家族[4],其中PHOT是感知蓝光的受体蛋白激酶。在模式植物拟南芥中研究表明,PHOT1和PHOT2以功能冗余方式调节弱光下的叶绿体聚积运动(Accumulation movement),使吸收光能的叶绿体面积达到最大,提高了弱光下植物的光合作用[5]。而PHOT2强光下单独介导叶绿体回避运动(Avoidance movement)[6],使叶绿体从强光下移开,沿细胞垂周壁排列,与光源平行,保护光合器官免受强光损伤[7]。另外,PHOT2参与调节草莓果实中花青素的积累[8]。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA,特异性地降解细胞内同源mRNA,从而阻断靶基因的表达,使靶基因发生沉默,表现出特定基因缺失的表型。RNAi技术可以快速分析靶基因的功能, 这为高效研究植物功能基因组提供了方便, 成为反向遗传学研究的重要工具之一[9]。本研究以烟草K326为材料,克隆了烟草PHOT2基因片段,构建了RNAi干扰载体,为验证PHOT2介导的叶绿体回避运动是高等植物普遍的运动提供了证据,同时也为PHOT2可能参与烟草香气形成、烟叶品质重要调节子的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 烟草K326。

1.1.2 菌种和质粒 大肠杆菌菌株DH5α,RNAi干扰载体pFGC5941为河南大学逆境生物学重点实验室保存;克隆载体pMD18-T simple购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3 试剂 限制性内切酶、Oligo dT18引物、DNA Marker、DNA凝胶纯化回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;Trizol试剂购自Invitrogen公司;高效连接试剂盒Soultion I和M-MLV反转录酶购自Promega公司;KOD-plus DNA聚合酶购自ToYoBo公司;抗生素(Amp, Kan)购自Solarbio公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs、普通PCR Buffer购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.4 引物 本研究使用引物见表1。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 取烟草K326幼苗0.1 g,液氮研磨,利用Trizol试剂进行RNA提取,提取的总RNA用DNaseⅠ处理去除DNA污染,并从电泳检测其质量,合格的总RNA进行反转录,合成cDNA 第一链,-20 ℃保存备用。

1.2.2 烟草PHOT2基因cDNA片段扩增 以番茄(Solanum lycopersicum)PHOT2基因序列(CDS)作为探针, 在TIGR网站上BLAST搜索烟草EST数据库,获得与探针序列同源性较高EST序列,进行引物设计。以烟草K326 cDNA为模板,利用引物F1和R1进行RT-PCR。将 PCR产物克隆到pMD18-T载体上,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,将经菌落PCR和质粒PCR鉴定后得到的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 RNAi表达载体的构建、鉴定与转化 根据测序结果,以克隆至pMD18-T载体的重组质粒为模板,以引物F2和R2作为正向引物,F3和R3为反向引物。将引物F2和R2进行PCR扩增的片段与pFGC5941RNAi载体进行连接、转化及酶切验证后,将得到的重组质粒pFGC5941-T1测序验证。然后按照相同的方法,将F3和R3引物扩增的相同片段克隆至测序正确的pFGC5941-T1质粒上,经检验测序正确后,用于后续试验。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

总RNA质量的优劣是反映反转录cDNA完整性的重要因素,同时也是扩增较长CDS片段的基础。利用Trizol试剂提取烟草K326幼苗的RNA后,利用200 V电压,1%琼脂糖非变性凝胶电泳检测(图1)。由图1可以看到,提取到3条清晰的条带分别为28S RNA、18S RNA及5.8S RNA,表明提取的RNA完整性较好。利用核酸分光光度计测定RNA的OD260 nm/OD280 nm介于1.8~2.0之间,表明无蛋白质和苯酚污染,说明RNA的纯度比较高。而后以此RNA为模板、Oligo dT18为引物,用M-MLV反转录酶进行mRNA的反转录,扩增得到cDNA。

2.2 PHOT2基因cDNA片段的克隆与测序

以F1和R1为引物,烟草K326 cDNA为模板,利用高保真KOD-Plus DNA聚合酶RT-PCR克隆了PHOT2基因cDNA片段。RT-PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s, 57 ℃退火40 s, 68 ℃延伸2 min,共30个循环;68 ℃延伸10 min,RT-PCR扩增产物如图2所示。将RT-PCR产物“加尾”后,用凝胶回收试剂盒回收并连接到pMD18-T simple载体上,经测序cDNA片段大小为2 052 bp。

2.3 PHOT2基因cDNA片段的生物信息学分析

利用NCBI中的ORF软件分析表明,该cDNA序列含有一个连续的开放阅读框(图3),可编码670个氨基酸。经BLAST同源性序列比对, 核苷酸序列与番茄PHOT2基因序列同源性达92%,推断的氨基酸序列与番茄PHOT2氨基酸序列同源性达91%。利用ScanProsite工具预测分析,所编码蛋白有蓝光受体PHOT家族的功能结构域特征[2],即N端包含有两个光感受区LOV1和LOV2, C端有一个进行磷酸化的激酶区(图4)。因此,推测该序列是烟草PHOT2基因的部分片段。

2.4 烟草PHOT2基因RNAi干扰表达载体构建

以烟草PHOT2基因cDNA序列为模板,PCR扩增出约445 bp正向片段PHOT2A(含XhoI和 NcoI酶切位点)和反向片段PHOT2B(含Sma I和BamH I酶切位点)(图5)。pFGC5941载体和正向片段PHOT2A(含XhoI和NcoI酶切位点)连接后转化大肠杆菌DH5α中,并将反向片段PHOT2B连接到重组质粒pFGC5941-PHOT2A中,酶切鉴定重组质粒pFGC5941-PHOT2 A-PHOT2B构建成功(图6)。

3 小结与讨论

利用目的基因缺失或表达沉默、超表达及同家族相关基因突变关联等方法获得遗传材料是目前研究基因功能的重要手段。RNAi技术的序列特异性、高效性和多效性,为大规模高效研究复杂的基因功能提供了技术平台。RNAi既可对同一基因家族内不同成员进行分别沉默,也可用于对整个家族进行有效沉默[10-12]。RNAi高效表达载体发夹结构最佳片段在200~600 bp之间,片段太短不利于构建载体操作,而且太短的双链RNA不能被DICER酶很好识别;而太长的片段在构建中容易引起重组,致使双链RNA结构上不太稳定。选择的序列位置可以是靶基因开放阅读框的全部或者部分序列,也可以是3′端、5′端的非翻译区[13]。

近年来,随着人们对植物蓝光受体及下游信号转导介导子的分离及鉴定,蓝光受体PHOT调节植物生长发育信号转导机制及挖掘其新功能的研究已成为研究者关注的热点之一。本研究以烟草的同科植物番茄的PHOT2基因序列为探针,克隆了一段烟草PHOT2基因序列,通过生物信息学预测,该片段已含有PHOT家族的功能区,构建了该基因的RNAi表达载体,为该基因功能研究奠定一定基础。由于同一家族的PHOT1和PHOT2序列同源性较高,烟草的PHOT1基因还没有克隆。因此,所构建的PHOT2 RNAi表达载体也有可能抑制PHOT1的表达。

教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献

[1] BAE G, CHOI G. Decoding of light signals by plant phytochromes and their interacting proteins[J]. Annu Rev Plant Biol, 2008, 59:281-311.

[2] LI Q H, YANG H Q. Cryptochrome signaling in plants[J]. Photochem Photobiol, 2007, 83:94-101.

[3] CHRISTIE J M. Phototropin blue-light receptors[J]. Annu Rev Plant Biol, 2007, 58:21-45.

[4] DEMARSY E, FANKHAUSER C. Higher plants use LOV to perceive blue light[J]. Curr Opin Plant Biol,2009,12:69-74.

[5] SAKAI T, KAGAWA T, KASAHARA M, et al. Arabidopsis nph1 and npl1: Blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:6969-6974.

[6] KAGAWA T, SAKAI T, SUETSUGU N, et al. Arabidopsis NPL1: A phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response[J]. Science, 2001, 291:2138-2141.

[7] WADA M, KAGAWA T,SATO Y. Chloroplast movement[J]. Annu Rev Plant Biol, 2003, 54: 455-468.

[8] KADOMURA-ISHIKAWA Y, MIYAWAKI K, NOJI S, et al. Phototropin 2 is involved in blue light-induced anthocyanin accumulation in Fragaria x ananassa fruits[J]. J Plant Res, 2013, 126: 847-857.

[9] ELBASHIR S, HARBORT H J, LENDECKEL W, et al. Duplexed of 21 nucleotide RNA media RNA interf erence in cultured mammalian cells[J]. Nature, 2001, 411: 494-498.

[10] TRAVELLA S, KLIMM T E, KELLER B.RNA interference-based gene silencing as an efficient tool for functional genomics in hexaploid breawheat[J]. Plant Physiol, 2006, 142: 6-20.

[11] ISHIHARA S, YAMAMOTO Y, IFUKU K, et al. Functional analysis of four members of the PsbP family in photosystem II in Nicotiana tabacum using differential RNA interference[J]. Plant Cell Physiol,2005,46:1885-1893.

[12] MIKI D, HOH R, SHIMAMOTO K.RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice[J]. Plant Physiol, 2005, 138: 1903-1913.

[13] WESLEY S V, HELLIWELL C A, SMITH N A, et al.Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. Plant J,2007,27:581-590.

(责任编辑 屠 晶)