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酶催化氧化法处理水中的己烯雌酚

  • 投稿游子
  • 更新时间2015-09-22
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李洪枚

(首都经济贸易大学安全与环境工程学院,北京 100070)

摘要:研究用辣根过氧化物酶(HRP)催化氧化法处理水中己烯雌酚(DES)的适宜工艺反应条件。试验考察了反应温度、pH和反应物反应计量比等对DES去除率的影响。结果显示,在pH4.5、25 ℃、[HRP]0/[DES]0为1.000 U/μmol和MH■O■∶MDES(反应摩尔比)为1∶2的反应条件下,反应3 h,DES去除率可达到92.08%。研究表明,HRP催化H2O2氧化DES反应的适宜条件是:pH4.5左右,温度25 ℃左右,[HRP]0/[DES]0为1.000 U/μmol,MH■O■:MDES宜大于0.5;过量H2O2抑制HRP催化活性;DES起始浓度越高,其去除速率越大;以底物DES去除速率表示的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为74.63 mmol/(L·h)和46.75 mmol/L。

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关键词 :酶催化氧化;处理;己烯雌酚

中图分类号:X131;TQ426.97 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2015)02-0331-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.019

己烯雌酚(diethylibestrol,DES)是一种人工合成的药用非甾体雌激素,与天然雌激素雌二醇有相同的功效,主要用于治疗雌激素低下症等疾病,部分女性保健品和化妆品中也含有一定量的DES[1]。DES是一种生物活性很强的环境激素,水体中微量DES可诱导雄鱼体内卵黄蛋白原明显升高,具有很强的内分泌干扰能力[2]。有研究显示孕妇吸收DES,其男孙代出现尿道下裂几率高[3]。DES还可引起基因突变而诱发癌症[4-6],长期食用含微量DES的食品可导致儿童性早熟、男性精子畸形和雌性化等危害[7,8]。因此,国内外对DES作为药物使用进行了严格限制,尤其是禁止将DES用作饲料添加剂[9]。遗憾的是,我国部分畜禽养殖企业为提高畜禽产量,违法在饲料中添加DES,导致禽蛋和肉类食品中DES残留量高达0.2~10.0 mg/kg,存在极大的健康隐患[10,11]。环境中的DES主要来自药品生产企业、医院、养殖企业和居民生活等产生的污水[12], 报道显示我国部分地区地表水中DES的浓度达到6 ng/L[13],部分城市的污水处理厂出水中DES的浓度为0.3~6.2 ng/L[14,15]。西班牙有关污水处理厂排出水中DES浓度为34 ng/L[16]。可见,现有污水处理工艺还不能有效去除水中DES。而国内外仅有几篇用光催化氧化法处理水体中DES的研究报道[17-21], 相关研究很少。酶催化氧化处理废水中有机污染物以其反应条件温和、反应快和选择性好等优点而受到广泛关注,本研究选用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)催化H2O2氧化水中微量DES,试验考察反应温度、pH、H2O2和DES初始浓度等反应条件对HRP催化氧化DES过程的影响,得到适宜的反应工艺参数,为进一步建立HRP处理实践中含DES废水新技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilgent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司), 色谱柱为Beckman Ultrasphere ODS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),Cary 50型紫外可见分光光度计(美国瓦里安公司),LY-1000型恒温培养振荡器(江苏金坛市亿通电子有限公司),PHS-3C型精密pH计(上海精密科学仪器有限公司),SKY-100C型恒温培养振荡器(上海苏坤实业有限公司),单道可调式移液器(德国Eppendorf公司,两种规格:10~200 μL和100~1 000 μL),FA2004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司),10 mL带有刻度的棕色避光瓶。

试验用试剂从Sigma-Aldrich公司购买,包括色谱纯试剂己烯雌酚、甲醇、乙腈和2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS),分析纯试剂双氧水(30%H2O2)、磷酸二氢钾、正磷酸(85%H3PO4)、冰乙酸、硼酸、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、氢氧化钾和氢氧化钠,生化试剂辣根过氧化物酶(HRP,250~330 U/mg)、过氧化氢酶(2 000~5 000 U/mg)和牛血清白蛋白(纯度大于98%),去离子水(Hitech-Sciencetool超纯水系统制备)。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液的配制 DES标准贮备溶液:准确称量2.5 mg DES,置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容备用(注:DES在水中几乎不溶,故用甲醇配制),浓度为0.093 27 mmol/L。考虑到酶促反应速度快及其与工业废水中DES浓度的相近程度,本试验采用DES初始浓度为0.037 3 mmol/L。

HRP溶液:准确称取1 mg HRP溶于250 mL去离子水中,再用单道可调式移液器移取1 mL HRP溶液于100 mL容量瓶中用去离子水定容,测得其活性为0.624 8 U/mL,置于4 ℃避光条件下保存待用, 保存时间不超过1周。

H2O2溶液:含30%H2O2的双氧水,密度为1.122 g/cm3。取1 mL双氧水于100 mL容量瓶中用去离子水定容,再从100 mL H2O2溶液中取1 mL于50 mL容量瓶中定容,此时配得的H2O2溶液浓度为1.96 mmol/L,4 ℃避光保存。H2O2溶液在使用之前配制。

过氧化氢酶溶液:准确称取0.531 4 mg过氧化氢酶溶于去离子水中配成10 mL溶液, 测得其活性约为170 U/mL[22], 过氧化氢酶溶液在使用之前配制。

Britton-Robinson缓冲溶液配制方法教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献[23]。

1.2.2 反应体系的建立 反应在10 mL带有刻度的棕色避光瓶中进行。首先通过计算确定好10 mL反应混合液中各组成部分所需要的量(体积),然后用单道可调式移液器依次移取一定量的DES标准储备溶液和HRP溶液至避光瓶中,再加入Britton-Robinson缓冲溶液,置于恒温振荡器中孵育15 min,最后加入H2O2溶液,使反应混合液总体积为10 mL。盖好避光瓶,并置于恒温培养振荡器中振荡(150 r/min)。定时取样,并加入一定量过氧化氢酶使H2O2分解而终止反应(可直接在离心管中进行)[24]。将样品离心10 min,移取上清液,分析DES残留浓度,计算DES去除率。

1.2.2 分析方法 DES浓度测定:用HPLC法,色谱条件是:色谱柱为Beckman UltraspHere ODS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇和水(70∶30,V/V),流速和进样体积分别为1.0 mL/min和5 μL,检测波长为240 nm,停留时间6.0 min,DES检测的标准方程:峰面积=9 891.6CDES-6.106 2,R2=0.998 6。每次检测做3个平行样品,误差小于5%。每次样品测量前都采用外标法确定DES校准曲线方程,再确定未知样DES浓度。

HRP活性测定采用ABTS法[25]。

2 结果与分析

2.1 pH对DES去除效果的影响

试验测量了不同pH条件下DES的去除率,考察反应体系pH变化对HRP催化氧化DES过程的影响。反应起始条件是:[DES]0=0.037 3 mmol/L,[H2O2]0=0.018 65 mmol/L,HRP起始活性为0.037 3 U/mL,反应温度为25 ℃,反应时间为60 min,反应体系的pH分别为3.16、3.98、4.51、4.90、6.00、7.00、8.08和9.03。结果如图1所示。

由图1可以看出,DES的去除率随pH的增加呈钟型变化,即在3.16~9.03范围内,DES去除率随pH增加先升高后降低;pH为4.51时,DES的去除率达到最高值93.62%;pH小于3.16或大于9.03时,DES去除率比较低,HRP催化活性受到限制。试验结果表明,HRP能在一个比较宽的pH范围内催化氧化DES,适宜pH为4.51。

HRP能在pH4.00~11.00范围内催化底物反应,因底物不同存在差异,催化多数底物反应的适宜pH在7.00左右,pH小于4.00或大于11.00时,HRP催化活性很低[26,27]。但也有研究报道HRP催化H2O2氧化五氯代酚的适宜pH范围为4.00~5.00[28],与本研究结果比较相近。因此,以下试验均选择pH为4.50的缓冲溶液作为酶促反应介质,以保持HRP催化活性的相对稳定。

2.2 温度对DES去除率的影响

反应起始条件是:[DES]0=0.037 3 mmol/L,[H2O2]0=0.018 65 mmol/L,HRP起始活性为0.037 3 U/mL,pH为4.50,反应时间为30 min,反应体系的温度分别为15、20、25、30、35和40 ℃。结果如图2所示。

由图2可以看出,DES去除率随着反应体系温度的升高而逐渐升高,当温度超过35 ℃时,去除率急剧下降;反应温度为25 ℃时,DES去除率达到最大值90.13%;温度在15 ~35 ℃范围内时,DES去除率均在80%以上。因此,HRP能在较宽的温度范围内催化氧化DES,适宜温度为25 ℃。温度对酶催化反应的影响表现在两个方面:一是随着温度升高,酶促反应活化分子增加,反应速率增大;二是反应温度升高到一定值后,酶蛋白会发生变性,失去催化活性,导致酶促反应速率下降。这两种相反效应使得酶促反应存在一个适宜的温度范围。试验结果表明,温度超过35 ℃时,HRP催化活性明显减弱,DES去除率仅为47%。研究HRP适宜的催化反应温度,有助于保护HRP的催化活性,提高DES去除率。

2.3 HRP与DES用量之比对DES去除率的影晌

酶的用量直接影响其工程应用成本,考察HRP用量对DES去除率的影响,选择最适宜的HRP用量([HRP]0表示酶起始用量,U/mL),对降低工程应用成本具有重要作用。反应起始条件是:[DES]0=0.037 3 mmol/L,[H2O2]0=0.018 65 mmol/L,pH为4.50,反应温度为25 ℃,[HRP]0/[DES]0起始比分别为0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 U/μmol,反应时间分别为30和180 min。结果如图3所示。

由图3可以看出,随着[HRP]0 /[DES]0增大, 即随着HRP起始用量增加,DES去除率升高。当[HRP]0 /[DES]0分别为0.250、0.5.00、1.000和2.000 U/μmol,反应180 min后,DES去除率分别为89.81%、90.67%、92.08%和90.51%, DES去除率相差比较小,表明[HRP]0 /[DES]0达到一定量后,能够满足底物去除要求,过多的酶对反应没有催化作用。[HRP]0/[DES]0小于0.25 U/μmol时,DES去除率比较小,表明酶量不足。综合考虑反应速度和HRP催化活性随反应过程进行而减弱等因素,宜选择[HRP]0/[DES]0=1.000 U/μmol作为反应体系中HRP与DES的最佳配比。

2.4 H2O2浓度对DES去除率的影晌

如果仅考虑H2O2与DES发生的氧化还原反应, 那么提高H2O2浓度,会加快反应速度,增大DES去除率。但过量的H2O2容易使HRP失去催化活性[20]。因此,必须综合考虑HRP催化活性和DES的去除率,选择适宜的H2O2用量。本试验在其他条件一定的情况下,通过改变H2O2浓度考察H2O2用量对DES去除率的影晌。反应起始条件是:[DES]0=0.037 30 mmol/L,HRP起始活性为0.037 30 U/mL,pH为4.50,温度为25 ℃,H2O2的浓度分别为0.004 66、0.009 32、0.018 65、0.037 30、0.074 60、0.149 20和0.298 40 mmol/L。结果如图4所示。

由图4可以看出,当H2O2浓度比较低时,如0.004 66和0.009 32 mmol/L,反应2 h,DES去除率小于70%,且反应速率(曲线的斜率)小,表明H2O2 浓度低,反应速率小,不能将DES全部氧化;当H2O2浓度处于0.018 65~0.074 60 mmol/L范围内时,反应2 h,DES去除率达到90%以上,反应速率大;H2O2浓度为0.074 60 mmol/L时,DES去除率达到最大值92.57%;当H2O2浓度达到0.149 20 mmol/L时,反应2 h后,DES去除率小于80%,表明H2O2浓度过高,对HRP催化氧化DES过程有明显的抑制作用,原因是过量H2O2与反应中间产物HRP-II进一步作用生成一种没有催化能力的副产物HRP-Ⅲ[29],从而降低DES的去除率。进一步用H2O2与DES的反应摩尔比进行分析,数据处理结果参见图5。图5是反应2 h后,DES去除率随MH2O2∶MDES的变化曲线。

由图5可以看出,MH2O2:MDES为1/8~2时,反应2 h后,DES去除率从60.13%上升到92.57%,DES去除率随MH2O2∶MDES增大而增大;当MH2O2∶MDES为4时,DES去除率下降明显,过量H2O2抑制了HRP催化反应过程。理论上讲,HRP催化氧化1 mol DES,只需要0.5 mol H2O2,即MH2O2∶MDES为0.5时,DES去除率应达到最大[21],但反应2 h,MH2O2∶MDES为0.5~2.0时,DES去除率分别为90.01%、91.05%和92.75%。显然,其他条件一定时,要完全氧化1 mol DES,MH2O2∶MDES需大于0.5。有关HRP催化H2O2氧化酚类底物的研究报道显示,MH2O2:M底物因底物不同比值可以为0.5[30]、1.0[31]和1.6[32]。反应消耗较多的H2O2,可能是由于底物氧化产物如二聚体小分子进一步被HRP催化氧化而增大了H2O2用量,使得H2O2用量高于理论用量[33]。

2.5 DES起始浓度对去除速率的影晌

本试验通过测量反应初始30 min内DES去除速率(用30 min内DES浓度变化除以30 min得到的平均反应速率, 即去除速率), 考察DES起始浓度对去除速率的影响,即对单位时间内DES浓度变化率的影响。反应初始条件是[H2O2]0=0.018 65 mmol/L,HRP起始活性为0.037 30 U/mL, pH为4.5,温度为25 ℃。DES初始浓度分别为0.018 70、0.027 80、0.037 30 、0.046 60和0.056 00 mmol/L,反应时间为30 min。结果如图6所示。

由图6可以看出,在反应的最初30 min内,DES去除速率随其起始浓度的增大而增大。原因是HRP催化H2O2氧化底物的4个反应步骤中, DES参与了其中的两个反应, DES浓度高,反应速率快,DES去除速率增大[34]。当DES起始浓度大于0.037 30 mmol/L时,DES去除速率增加幅度开始减小,表明酶催化初始反应速率受HRP量的限制,过多的DES对反应速率影响很小。进一步用双倒数法(浓度倒数和速率倒数)处理实验数据,可得到以底物DES表示的最大反应速率Vmax和米氏常数Km,

(图7),V是DES去除速率(30 min内的DES平均去除速率),单位为mmol/(L·h)。可以求出Vmax=74.63 mmol/(L·h),Km=46.75 mmol/L。本试验结果得到Km值比HRP催化17β-雌二醇等雌激素反应的米氏常数大[35],原因可能是本数据处理使用30 min内的平均速率代替初始反应速率,存在一定的误差。当然,底物不同,同一种酶催化底物反应的Vmax和Km也不同。

3 结论

试验得出以下结论:

1)HRP 催化H2O2氧化DES的适宜pH为4.51。

2)HRP催化H2O2氧化DES的适宜温度为25 ℃。

3)DES去除率随[HRP]0/[DES]0增大而升高。当[HRP]0/[DES]0大于0.5 U/μmol时, DES去除率超过90%。[HRP]0/[DES]0的适宜比值为1.000 U/μmol。

4)HRP催化H2O2氧化DES的MH2O2∶MDES宜大于0.5,以确保DES的去除率达到100%。H2O2用量过高,会抑制HRP催化活性,不利于DES的去除。

5)DES起始浓度越高,其去除速率越大。以底物DES表示的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为74.63 mmol/(L·h)和46.75 mmol/L。

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(责任编辑 蔡端午)