曹学顺，丁君，白雪秋，常亚青
（大连海洋大学/农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023）
摘要：为获知升温对‘水院1 号’和大连养殖刺参相关免疫酶活性及MDA含量的影响，实验设置不同温度梯度(16、20、24、28℃)，分别对‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、溶菌酶(LSZ)的活性及丙二醛(MDA)含量进行测定。结果显示：（1）在升温过程中，‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中CAT、SOD、POD活性均呈先升高后降低的趋势。CAT活性范围分别为77.160~151.76、24.617~51.740 U/mL；SOD活性范围分别为0.070~0.154、0.056~0.100 U/mL；POD活性范围分别为2.360~3.470、1.407~2.407 U/mL。‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中LSZ活性均呈先升高再降低又升高的趋势，活性范围分别为9.741~30.898、8.554~28.006 U/mL。‘水院1 号’刺参体腔液中MDA含量随着水温升高逐渐降低，其含量范围为42.331~46.563 nmol/mL，大连养殖群体刺参体腔液中MDA含量呈先降低后升高的趋势，变化范围为46.079~47.329 nmol/mL。（2）在升温过程中，‘水院1 号’刺参体腔液中CAT、SOD、POD和LSZ 活性变化较大连养殖群体刺参的变化差异大，其中CAT和POD活性变化差异显著(P<0.05)。在28℃水温下，‘水院1 号’刺参MDA含量显著小于大连养殖群体刺参MDA含量(P<0.05)。研究表明，刺参能够对水温升高及时地做出生理免疫反应，通过调节非特异性免疫酶活性来清除机体内多余的活性氧，保护机体免受环境改变造成的损害。研究发现，‘水院1 号’刺参较大连养殖群体刺参反应更为灵敏，对高温的适应性更强。本研究为探讨刺参对高温适应性和对‘水院1号’品种推广具有一定意义。
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关键词 ：刺参；升温；免疫酶；丙二醛
中图分类号：S968.9 文献标志码：A 论文编号：2014-0269
The Study of Rising Temperature on Serum Non-specific Immune in Shuiyuan NO.1 Sea
Cucumber Populations and the Cultured Sea Cucumber Populations
Cao Xueshun, Ding Jun, Bai Xueqiu, Chang Yaqing
(Dalian Ocean University, Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea,Ministry of Agriculture,College of Fisheries and Life science, Dalian 116023, Liaoning, China)
Abstract: The experiment studied the change of non-specific immune in rising temperature (16℃, 20℃, 24℃,28℃). The activities of CAT, SOD, POD, LSZ and the content of MDA in Shuiyuan NO.1 sea cucumber andDalian cultured sea were analyzed. The result show that: (1) in rising temperature,the change of CAT, SOD,POD were trend to increased and to decreased in Shuiyuan NO.1 sea cucumber and Dalian cultured seacucumber, the activities of CAT were 77.160-151.76 U/mL and 24.617-51.740 U/mL, the activities of SODwere 0.070-0.154 U/mL and 0.056~0.100 U/mL, the activities of POD were 2.360-3.470 U/mL and 1.407-2.407 U/mL. The change of LSZ was first increased and then decreased and increased, the activities of LSZwere: 9.741-30.898 U/mL and 8.554-28.006 U/mL. The content of MDA in Shuiyuan NO.1 sea cucumber wastrend to increased, the change of MDA was 42.331-46.563 nmol/mL.The content of MDA in Dalian culturedsea cucumber was trend to decreased and to increased, the change was 46.079-47.329 nmol/mL.(2) In risingtemperature, the change of CAT, SOD, POD, LSZ in Shuiyuan NO.1 sea cucumber were more sensitive than inDalian cultured sea cucumber, and the change of CAT and POD had significant difference (P <0.05). In 28℃,the content of MDA in Shuiyuan NO.1 sea cucumber was significantly less than in Dalian cultured seacucumber (P <0.05). The study indicated that Apostichopus japonicus (Selenka) could make certain physiologicalimmune response to elevated temperatures, to rid the body of excess free radicals by regulating the immunedefense enzyme activity, to protect body from damage caused by environmental change. Shuiyuan NO.1 seacucumber was more sensitive and had hight adaptation in high temperature than Dalian cultured sea cucumber.The experiment was important to study the high temperature adaptation ofApostichopus japonicus (Selenka)and to promote Shuiyuan NO.1 sea cucumber.
Key words:Apostichopus japonicus (Selenka); Heating; Immune; Malondiadehyde
0 引言
水温作为最重要的生态因子之一，对刺参生长和生理生态特征起到非常重要的作用[1]。刺参所能适应的水温范围为0~30℃，最适生长温度为15~18℃[2]。超出适宜水温可造成刺参体内自由基代谢紊乱，自由基在体内大量累积，继而影响刺参体内免疫系统的防御能力，损害刺参健康。温度过高或过低都会抑制刺参生长，增加发病率[1]。另外在夏季水温升高时，刺参为适应高温环境会进入夏眠，停止摄食，体重减轻，且刺参体腔液非特异性免疫酶活性发生明显变化[3]。因此，研究升温对刺参体腔液中免疫酶活性的影响对于探讨其对高温环境的适应机制和健康养殖具有一定借鉴意义。
刺参对水温的适应具有特殊性和复杂性，与刺参年龄及规格有关，规格越大，其适宜生长温度越低[1]。目前温度对水生动物的生理影响的研究比较广泛。Wang F 等[3-4]研究了夏眠期间刺参体腔液内免疫酶活性变化，Ji 等[5]研究了升温与夏眠过程中刺参的免疫生理反应，刘伟等[6]初步探讨了温度骤降和缓降对刺参体腔液中主要免疫酶的影响，Dong 等[7]研究了在不同幅度的日变温处理下，刺参体内CAT 和SOD 活性变化，An等[8]研究了高温下刺参食物吸收率和食物转化率的变化，Dong等探讨了高温驯化下刺参的热耐受性[9]及对其它生态因子的耐受能力[7]。另外也有学者研究了褐牙鲆[10]、中华绒螯蟹[11]、青蛤[12-13]、虾夷扇贝[14]、贻贝[15]等水生动物体内非特异性免疫酶活性与温度之间的关系。
2009 年大连海洋大学培育出的刺参新品种‘水院1 号’是国家审定通过的第1 个刺参养殖新品种，具有苗种成活率高、生长快、肉刺多等特点[6,16]。本研究以‘水院1 号’刺参和大连养殖群体刺参为材料，研究在水温缓升条件下，两群体刺参体腔液中非特异性免疫酶活性和MDA含量的变化，为探讨刺参对高温的适应机制和刺参健康养殖具有参考价值，同时也为研究‘水院1 号’对高温条件的适应性及对其的推广有一定意义。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验选用大连海洋大学农业部北方海水增养殖
重点实验室培育的‘水院1 号’刺参(158.63 g±32.46 g)和2013年购于大连某养殖场的刺参(148.42 g±25.21 g)。实验开始前取‘水院1 号’刺参和大连养殖群体刺参各30 头，分别暂养于控温水槽中2 周，养殖温度为16℃，正常养殖管理。
1.2 升温模式及取样
利用控温水槽将养殖刺参水温从16℃开始升温，每天水温升高1℃，每个温度点维持1 天，实验持续16天，分别在16、20、24、28℃时取’水院1 号’刺参和大连养殖群体刺参各5 头，抽取刺参体腔液，放入-80℃冰箱保存，留作待测样本。
1.3 刺参体腔液中免疫酶及丙二醛含量测定
每个待测样品设置3 个平行，实验采用CAT、SOD、POD、LSZ 的酶活性测试盒及MDA含量测试盒（南京建成生物研究所）检测刺参体腔液中相应的免疫酶活性及MDA含量，利用Epoch 酶标仪（美国Biotek公司）测定酶活性及MDA含量。
1.4 数据处理
实验所得数据利用Excel 软件进行初步整理，后用spss17.0 软件中单因素方差分析处理各温度点下刺参体腔液中CAT、SOD、POD、LSZ 的活性及MDA含量的数据，利用Duncan 多重比较分析同群体不同温度点间和不同群体间刺参各非特异性免疫酶活性和MDA含量的差异显著性，显著性水平设置为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 升温对’水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中CAT活性的影响
‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中CAT活性变化结果见图1。随着水温升高，‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中CAT 活性均呈先升高后降低的趋势。随着水温升高，大连养殖群体刺参CAT活性20℃时达到最高，为68.05 U/mL；28℃时CAT 活性降到最低，为17.84 U/mL(P<0.05)。“水院1 号”刺参CAT活性变化趋势与大连养殖群体刺参CAT活性变化一致，在24℃时CAT活性达到最高，为200.99 U/mL；在28℃时CAT活性显著降低，达到77.160 U/mL(P<0.05)。‘水院1 号’刺参体腔液中CAT 活性在各温度点均大于大连养殖群体刺参CAT活性，在24℃和28℃水温下，‘水院1 号’刺参CAT活性显著高于大连养殖群体刺参CAT活性(P<0.05)。
2.2 升温对’水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中SOD活性的影响
‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中SOD 活性变化见图2。随着水温升高，‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中SOD活性均呈先升高后降低的趋势。随着水温升高，大连养殖群体刺参体腔液中SOD活性逐渐升高，在24℃时达到最高，为0.100 U/mL；28℃时SOD 活性降到最低，为0.056 U/mL，显著低于24℃时SOD 活性(P<0.05)。‘水院1 号’刺参SOD 活性在24℃时达到最高，为0.154 U/mL；28℃时，SOD活性降到最低，为0.070 U/mL，显著低于24℃时SOD 活性(P<0.05)。‘水院1 号’刺参SOD活性在各温度点均大于大连养殖刺参SOD活性，但差异不显著(P>0.05)。
2.3 升温对’水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中POD活性的影响
‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中POD 活性变化见图3。随着水温升高，‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中POD活性均呈先升高后降低的趋势。大连养殖群体刺参体腔液中POD活性在20℃水温时达到最高，为2.407 U/mL，显著高于其他3 个温度点下POD活性(P<0.05)；28℃时POD活性最低，为1.407 U/mL。‘水院1号’刺参体腔液中POD 活性在20℃时达到最高为3.470 U/mL；28℃时POD活性降到最低，为2.360 U/mL；20℃与24℃时POD活性差异显著(P<0.05)。升温过程中，‘水院1 号’刺参在16、24℃及28℃水温下POD活性均显著高于大连养殖群体刺参POD活性(P<0.05)。
2.4 升温对’水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中LSZ活性的影响
‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中LSZ活性变化见图4。随着水温升高，‘水院1 号’和大连养殖群体刺参体腔液中LSZ 活性均呈先升高再降低又升高的趋势。水温20℃时，大连养殖群体刺参体腔液中LSZ活性达到最高，为28.006 U/mL；24℃时降到最低，为8.554 U/mL，显著低于20℃时LSZ 活性(P<0.05)；28℃时，LSZ活性有所升高，为22.523 U/mL。‘水院1 号’刺参在20℃时LSZ 活性达到最高，为30.898 U/mL；24℃时，LSZ 活性显著降低(P<0.05)，为9.741 U/mL；28℃时，LSZ 活性升至24.201 U/mL。升温过程中，‘水院1号’刺参LSZ 活性在各温度点均大于大连养殖刺参LSZ活性，但差异不显著(P<0.05)。
2.5 升温对’水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中MDA含量的影响
生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛(MDA)，MDA含量可以间接反映生物机体受损伤的程度。‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中MDA含量变化见图5。随着水温升高，大连养殖群体刺参体腔液中MDA含量呈先降低后升高的趋势，24℃时MDA 含量降到最低，为46.079 nmol/mL；28℃时MDA含量达到最高，为47.329 nmol/mL，各温度点MDA含量差异不显著(P>0.05)。‘水院1 号’刺参体腔液中MDA含量随着水温升高逐渐降低，其含量值分别为46.563、46.079、45.455、42.331 nmol/mL，28℃时MDA含量显著降低(P<0.05)。水温28℃时，‘水院1号’刺参体腔液中MDA含量显著小于大连养殖群体刺参体腔液中MDA含量(P<0.05)。
3 讨论
3.1 升温对‘水院1 号’刺参和大连养殖群体刺参免疫酶活性的影响
在自然生长过程中，随着环境温度的变化，刺参机体的生理免疫等反应会发生一定的变化。温度升高，会导致刺参代谢水平的变化，增加活性氧的形成，过量的活性氧会打破其和抗氧化系统之间的平衡，导致氧化胁迫，引起机体组织损伤[17]。在刺参抗氧化系统中，CAT和SOD是最先和最重要的防御机制[18]。CAT是生物体内过氧化物酶体的标志酶，能够催化过氧化氢分解，防止膜脂过氧化。SOD是第1 个对抗活性氧自由基的抗氧化酶，参与清除体内超氧阴离子自由基(O2-)，可以防机体损伤和衰老[19]。本研究结果显示，随着水温升高，‘水院1 号’和大连养殖刺参体腔液中CAT 和SOD活性均呈先升高后降低的趋势，这与Ji 等[5]、Dong 等[7]、徐东东等[10]、洪美玲等[11]的研究结果一致。说明在升温过程中，刺参能够通过提高CAT和SOD活性来清除多余的活性氧，在无脊椎动物中CAT 和SOD活性随温度升高变化趋势具有一致性。当水温从24℃升至28℃时，刺参机体内CAT和SOD活性均降低，分析原因可能是刺参经历温度过高导致CAT和SOD活性受到抑制。
POD也是抗氧化系统中的关键酶，能够催化过氧化氢反应，与CAT、SOD 一起在环境胁迫下清除机体内多余的活性氧自由基保护细胞。吴丹华等[20]报道了在低温胁迫下三疣梭子蟹血清中POD活性呈先升高后降低的趋势。目前还未见在高温下刺参POD活性变化的报道。本研究显示，随着温度升高，刺参体腔液中POD活性也呈现先升高后降低的趋势，表明刺参为防御机体免受升温的刺激，机体提高了POD活性来适应高温，在28℃水温下，POD 活性显著降低(P<0.05)，推测是因水温过高，POD活性受抑制。
LSZ 是吞噬细胞杀菌的物质基础，能够清除侵入体内的异物，达到保护机体的目的[21]。温度对LSZ 活性变化起着重要影响[22]。Wang 等[3]的研究结果表明刺参LSZ活性从夏眠前期至夏眠期逐渐升高，11 月底显著下降。华育平等[23]的研究表明史氏鲟血清中LSZ活性随着温度升高而升高，Langston 等[24]报道了升温会造成大西洋鰈鱼血清内LSZ 酶活性增强。王天坤等认为处于免疫临界温度范围内，克氏原螯虾LSZ活性随温度升高而升高，超出范围时，因温度胁迫产生应激反应，导致生理功能失调，机体免疫力下降，感染疾病[25]。本实验结果显示，升温过程中刺参LSZ活性先升高后降低又升高，推测刺参体腔液中免疫酶的作用也有一定的次序，随着水温升高机体内CAT、SOD和POD活性降低后，LSZ活性升高，保护机体免受损伤。
MDA含量可以反映生物机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度[26]。研究发现，随着水温升高，‘水院1 号’刺参体腔液中MDA含量逐渐降低，大连养殖群体刺参体腔液中MDA含量先降低后升高，与CAT、SOD、POD的变化趋势相反，与张喆等[27]研究结果相似。大连养殖群体刺参MDA含量在28℃下达到最高，推测是由于刺参在高温胁迫下，CAT、SOD和POD活性受到抑制，不能及时清除机体内产生过多的活性氧，引发脂质过氧化作用，导致MDA含量增加。
3.2 升温过程中’水院1 号’刺参和大连养殖群体刺参免疫酶活性变化的差异
研究发现，在升温过程中，‘水院1 号’刺参和大连养殖群体刺参能够通过调节非特异性免疫酶活性来适应温度升高造成的影响，保护机体免受损伤。随着水温升高，‘水院1 号’刺参体腔液中CAT、SOD、POD和LSZ 活性变化较大连养殖群体刺参的变化大，其中CAT 和POD活性变化差异显著(P<0.05)，表明‘水院1号’刺参能够对水温升高做出更大应激反应，通过调节免疫酶活性来平衡机体内氧化过程与抗氧化系统，保护机体免受损害，表现出对高温的适应性。‘水院1 号’刺参MDA含量在各温度点均小于大连养殖群体刺参MDA含量，且在28℃水温下差异显著(P<0.05)，表明在升温过程中‘水院1 号’刺参的机体细胞受损程度小于大连养殖群体刺参，‘水院1 号’刺参对高温的适应性较普通刺参强。因此，‘水院1号’的推广更有意义。
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