黎建斌，李大列，黄光华，吕敏
（广西水产科学研究院，广西 南宁 530021）
摘要：本试验选择5 L无色透明聚乙烯塑料瓶作为培养容器，接种后置于室外自然光源下进行光照培养。采用单因子优化试验探讨不同的光照度、初始pH值、初始接种浓度、氧需求程度、摇动次数等对光合细菌生长的影响。结果表明：其最适光照度6 000～8 000 lx、初始pH值为7.0～7.5、最佳接种量为30%、厌氧培养、每天摇动1～2次，一般培养6 d可使光合细菌活菌数≥4×109个/mL，杂菌率≤10%。
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关键词 ：光合细菌；室外；快速扩培
光合细菌（Photo Synthetic Bacteria简称PSB）是一类能够在厌氧和光照条件下进行光合作用且不产生氧气的一类细菌的总称。它广泛存在于自然界的湖泊、江河、海洋、水田、氧化池、活性污泥槽、污水沟内，其菌体营养丰富，细胞干物质中蛋白质含量达60%以上，而且蛋白质氨基酸组成齐全，含有机体必需的16种氨基酸且各种氨基酸的比例较合理。还含有丰富的B族维生素，尤其是维生素B12、叶酸、生物素等含量高[1]。大量的应用研究证明，光合细菌可明显提高养殖动物的生长速度和抗病能力，而且具有重要的优化水质，改善养殖环境的功能，在畜牧、水产养殖和环境污水治理等领域都有非常重要和广泛的应用前景。目前，对光合细菌培养条件的研究，国内外已有许多相关报道，但众说不一，均停留在室内用灯光培养。这种培养方式耗能大、成本高，不利于光合细菌的推广应用。因此，如何因地制宜利用空闲地在自然环境条件下快速扩培光合细菌已成为迫切需要解决的技术问题。为此，我们承担了广西直属公益性科研院所基本科研业务费专项资金自主选题项目“光合细菌快速扩培技术研究”，采用单因子优化试验考察不同的光照度、初始pH值、初始接种浓度、氧需求程度、摇动次数等对光合细菌生长的影响。
1试验材料
1.1试验菌株
试验菌株PSB由广西水产科学研究院南宁海可海乐微生物公司从高产虾塘底泥中分离获得并培养保存，经鉴定为红螺菌科沼泽红假单胞菌(菌株编号NC01)，活菌数≥4×109个/mL，杂菌率≤10%，深红色，粘稠状液体。
1.2培养基
液体配方：使用广西水产科学研究院南宁海可海乐微生物公司优化筛选的扩大培养基，其基本成分如下[2]： CH3COONa 3.3 g、KH2PO4 0?60 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 2.00 g、 MgSO4·7H2O 0.3 g、CaCl2 50 mg、MnSO4 25 mg、FeSO4 5.00 mg、酵母膏 1.0 g、调节pH值至 7.0、曝气自来水 1 000 mL。
2光合细菌生长的测定
菌体浓度：用7504型分光光度计，在660 nm波长处,测定培养物光密度值（OD）；
细胞数量：用光合细菌基础培养基[3]，以平板菌落计数法测定。
3室外培养参数的优化
3.1光照度对光合细菌生长的影响
将活化后的菌种以30%接种于已灭菌的培养基中，置于室外自然光源下（温度控制在35 ℃左右），采用增减遮阴网疏密来调节光照度，设置5个梯度：分别为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 lx，每个梯度设置2个重复，静置培养6 d后取样测定，探讨其生长情况。
从表1可见，光合细菌在光照强度2 000～10 000 lx的范围内均可以生长，而且在2 000～8 000 lx范围内，光强度越大，光合细菌的生长速度就越快，生物量也越大，而且菌液粘稠均匀，无分层、无附壁。但在10 000 lx强光照度下，光合细菌的生长明显受到了抑制，菌液颜色发生变化且分层、附壁现象较严重。因此，光合细菌比较适宜在光强度为6 000～8 000 lx下培养。在实际批量生产过程中可采用增减遮阴网疏密来调节光照度实现室外自然光照培养。
3.2初始pH值对光合细菌生长的影响
先配制液体培养基，采用1 mol/L的醋酸和5%碳酸氢钠溶液调节液体培养基的初始pH值。共调节6个梯度，分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每个梯度设置2个重复。将活化后的菌种以30%接种于已灭菌的培养基中，置于室外温度控制在35 ℃左右、6 000 lx光照度下静置培养6 d后取样测定，探讨其生长情况。
从表2得知，光合细菌在pH值6.5～9.0范围内均能良好生长，但不同的初始pH值对光合细菌生长产生不同影响。从测定的数据可以看出，各组之间，OD值、活菌数量差异明显。初始pH 7.0时生长最好，OD值达1.98、最高活菌数量达4.38×109个/mL，其次是pH 7.5。最差是pH 9.0，OD值为0.65、最高活菌数量1.44×109个/mL。由于光合细菌的代谢产物为碱性，随着培养时间的递增，各组pH呈现不断上升的趋势，光合细菌活菌数量也不断增加。因此，在培养过程中，必须随时测定和调整pH值，pH值过高或过低对光合细菌的生长都不利。为了延长光合细菌的对数生长期，当pH值上升超出最适范围时，可以采用加1 mol/L的醋酸溶液调整菌液pH值。
3.3初始接种浓度对光合细菌生长的影响
将活化后的菌种以10%、20%、30%、40%、50%接种于已灭菌的培养基中，每个梯度设置2个重复。置于室外温度控制在35 ℃左右、6 000 lx光照度下静置培养6 d后取样测定，探讨其生长情况。
从表3得知，初始接种浓度对光合细菌生长的影响很大，初始接种浓度越高，光合细菌的生长就越快，达到最高活菌数量的时间就越短。比较不同初始接种浓度对光合细菌生长的影响发现，初始接种浓度在20%～40%时对最终的生物活菌数量影响不大，而初始接种浓度在10%时，光合细菌在培养液中很难占绝对优势，培养初期易长杂菌，生长缓慢。初始接种浓度在50%时，生长速度快、很容易形成优势菌群而抑制其他杂菌生长、培养周期较短，但从大批量生产的角度来讲，成本相对较高；初始接种浓度低，培养周期相对有所延长，但成本降低。综合考虑各方面的因素，在室外大批量生产中，建议采用30%初始接种浓度，相对延长培养时间的方法来提高活菌数量。
3.4氧需求程度对光合细菌生长的影响
氧需求程度的调控设置3个梯度，分别为：完全厌氧培养、有孔瓶盖培养、开盖培养，每个梯度设置2个重复。将活化后的菌种以30%接种于已灭菌的培养基中，置于室外温度控制在35 ℃左右、6 000 lx光照度下静置培养6 d后取样测定，探讨其生长情况。
从表4得知，光合细菌在完全厌氧、有孔瓶盖培养、开盖培养条件下均能进行正常的生理活动。但不同的氧需求程度对光合细菌最终的OD值、活菌数影响还是比较大的。在有孔瓶盖培养条件下生长代谢最为旺盛，最高活菌数达4.31×109个。其次是完全厌氧，最高活菌数3.98×109个。最差是开盖培养，由于杂菌感染，生长缓慢最高活菌数仅有2.26×109个。完全厌氧与有孔瓶盖培养相比，差异不明显，但与开盖培养相比，则差异显著。由于是室外培养，考虑到受天气等外界条件的影响，因此采用完全厌氧培养方式是切实可行的。
3.5摇动次数对光合细菌生长的影响
摇动次数的调控设置3个梯度，分别为：每天摇动次数1次、2次和不摇动的培养方式。将活化后的菌种以30%接种于已灭菌的培养基中，置于室外温度控制在35 ℃左右、6 000 lx光照度下静置培养6 d后取样测定，探讨其生长情况。
从表5结果表明，在培养过程中适当摇动对光合细菌的生长还是非常有利的，摇动1次，2次的OD值、活菌数明显高于不摇动。适当摇动可以使沉底的光合细菌上浮，在培养液中分布更加均匀，更好地获得光照，从而促进细胞的更好生长。因此，在培养过程中建议每天摇动1～2次。
4结论
本研究结果表明，光合细菌快速扩培最为关键的技术问题就是创造有利于光合细菌生长的良好环境及减少杂菌的污染。其最适光照度6 000～8 000 lx、初始pH值为7.0～7.5、最佳接种量为30%、厌氧培养、每天摇动1～2次，一般培养6 d可使光合细菌活菌数≥4×109个/mL，杂菌率≤10%，为在自然环境条件下快速扩培光合细菌提供有效的技术支撑。
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参考文献：
[1]
占家智,羊茜,吴青,等.水产活饵料培育新技术[M].北京：金盾出版社，2002
[2] 黎建斌,何为,李大列,等.高活性荚膜红假单胞菌分离鉴定及应用[J].南方农业学报,2012,34（4）:540-543
[3] 邱宏端,腾蓉,陈雷鸣,等.荚膜红假单胞菌应用型扩大培养液的优化实验[J].大连水产学报,2001,16(1): 29-33
（收稿日期：2014-12-12）