吴今人１ａ，耿 平１ａ，胡田叶１ａ，霍晨曦１ａ，江 海１ａ，1ｂ，郭念文２，刘惠钧３
（１． 陕西理工学院，ａ．生物科学与工程学院；ｂ．陕西省资源生物重点实验室 陕西 汉中 ７２３００1；２．陕西泛亚绿色食品有限公司，陕西 城固 ７２３２００；３． 陕西省城固酒业有限公司，陕西 城固 ７２３２００）
摘要：利用ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ检测柑橘不同部位中的柠檬苦素含量，以了解柑橘中苦味物质的分布规律，从而为柑橘产品深加工提供依据。试验采用色谱柱Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８（５０ ｍｍ ×２．５ ｍｍ，１．９ μｍ）；流动相：Ａ为乙腈，Ｂ为纯水，梯度洗脱，乙腈梯度为１０％（０ ｍｉｎ）－５０％（３ ｍｉｎ）－１０％（４ ｍｉｎ）－１０％（５ ｍｉｎ）；流速０．３ ｍＬ／ｍｉｎ、柱温４０ ℃、进样量５ μＬ、检测时间５ ｍｉｎ；正离子模式（ＥＳＩ＋）质谱检测器：柠檬苦素母离子ｍ／ｚ＝４７１．１；定性离子ｍ／ｚ＝４２５．３，定量离子ｍ／ｚ＝１６１．１；等等。结果表明，柑橘不同部位中柠檬苦素的含量差异显著，橘茎、橘叶、橘花、橘皮、橘络、橘肉、橘子的柠檬苦素含量分别为９８０．５±１５．８、８８０．０±１０．２、２ ５００．０±３０．５、７６８．４±９．６、１ ７８０．０±２０．５、２２０．２±８．１、３ ２００．０±３５．１ ｍｇ／ｋｇ。说明柑橘中柠檬苦素主要分布于橘花、橘络、橘子中，可以通过橘花、橘子提取；所以在柑橘加工过程里，为避免苦味的产生，应尽量剔除橘络和橘子。
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关键词 ：柑橘；柠檬苦素；分布；含量
中图分类号：Ｓ６６６；Ｏ６２９．６＋１；Ｑ９４６－３３ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）04－0882-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.04.028
收稿日期：２０１４－０４－１４
基金项目：陕西省教育厅科研项目（２０１１ＧＪ２１；２０１１ＪＳ０３３）；陕西理工学院大学生创新创业训练计划项目（ＵＩＲＰ１３０４０）
作者简介：吴今人（１９９３－ ），男，陕西汉中人，２０１１级本科生，研究方向为食品质量安全控制，（电话）１３９０９１６２８９５；通信作者，江 海（１９７７－），男，四川西昌人，高级实验师，硕士，主要从事食品质量与安全控制技术研究，（电子信箱）ｊｉａｎｇｈａｉ０３１８＠１６３．ｃｏｍ。
柑橘属（Ｃｉｔｒｕｓ Ｌ．）是芸香科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）柑橘亚科（Ａｕｒａｎｔｉｏｉｄｅａｅ）植物，以柠檬［Ｃ． ｌｉｍｏｎ（Ｌ．）Ｂｕｒｍ．Ｆ］、柚［Ｃ．ｍａｘｉｍａ（Ｂｕｒｍ．）Ｍｅｒｒ．］、葡萄柚（Ｃ． ｐａｒａｄｉｓｉ Ｍａｃｆ）、甜橙［Ｃ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ．）Ｏｓｂｅｃｋ］、宽皮橘（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ Ｂｌａｎｃｏ）为主要栽培种类［ｌ－４］，在世界上分布于南纬、北纬４０°的热带、亚热带的１３５个国家和地区，是世界上种植面积最大、产量最多的商品水果之一［５－７］。柑橘是一种古老的果树，在中国有四千多年的栽培历史。柑橘中富含糖、维生素、纤维素、胡萝卜素、橙皮苷、柚皮苷、柠檬苦素等物质，其中橙皮苷、柚皮苷、柠檬苦素既是柑橘的风味物质，同时也是柑橘及其加工产品苦味的主要来源。柠檬苦素是一种三萜类的植物次生代谢产物，广泛存在于柑橘属植物中，至今已从柑橘属植物中分离出了３６种柠檬苦素类似物及１７种柠檬苦素类似物配糖体［８，９］。据报道，柠檬苦素在水溶液中的苦味阈值约为１×１０－６ ｍｏｌ／Ｌ。有强烈苦味的柠檬苦素如果在柑橘果汁中的含量超过６ ｍｇ／Ｌ，那么这种柑橘就不适合用于果汁加工［１０］。
柠檬苦素对柑橘的加工有一定的负面影响，但柠檬苦素类化合物在抗癌、镇痛、调节体内胆固醇水平、防止动脉粥样硬化和除虫等方面具有明显效应［１１］，柠檬苦素类似物除以上的生物学功效之外，还具有抗氧化、抗菌、抑制ＨＩＶ、利尿、改善心脑血管循环及睡眠、抗病毒、调节细胞色素等作用，具有很好的保健功能［１２，１３］。柑橘中的柠檬苦素类物质是柑橘产品开发利用过程中重要的苦味来源，是影响柑橘产品品质的主要因素；同时，因为柑橘中的这些苦味物质在医药、临床治疗以及食品生产中具有一定的功效，所以摸清柑橘中柠檬苦素类物质的分布规律就具有重要意义。
目前分析柠檬苦素的主要方法有光谱分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、色谱－质谱联用法、微波法，萃取法［１４－１６］。试验在借鉴前人研究的基础上，采用超高效液相色谱－串联质谱法（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析了柑橘不同部位中柠檬苦素的含量，旨在摸清柑橘植株中柠檬苦素的分布规律，为柑橘的加工去苦和柠檬苦素的提取提供试验依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料 柑橘的茎、花、叶、果皮、果肉、橘络、橘子等均采于陕西泛亚绿色食品有限公司城固县郭家山柑橘种植基地，样品都于烘箱内６０ ℃烘干、粉碎后过６０目分样筛，备用。
１．１．２ 试剂 主要有柠檬苦素（纯度为９９．８％，天津一方科技有限公司）、甲醇（分析纯，天津市登峰化学试剂厂）、乙腈（色谱纯，Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ 公司）、纯水（杭州娃哈哈矿泉水）。其他为实验室常用的试剂如石油醚、丙酮等。
１．１．３ 仪器 主要有Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ－ＵＰＬＣ－ＴＱＤ（美国Ｗａｔｅｒｓ公司）、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＡＵＷ２２０Ｄ电子天平（日本岛津公司，感量１／１００ ０００）、ＫＱ１００－ＤＡ超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、１０１－３Ａ型电热恒温鼓风干燥箱（上海沪南电炉烘箱厂）、ＺＮ－０２中草药粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；其他为实验室常规仪器。
１．２ 方法
１．２．１ 样品制备 称取干燥、粉碎后的柑橘茎、花、叶、果实、果皮、橘络、橘子样品各０．２００ ｇ于２５０ ｍＬ的圆底烧瓶中，量取５０ ｍＬ石油醚（３０~６０ ℃）于４０ ℃超声脱脂３０ ｍｉｎ，抽滤，弃去滤液；向滤渣中加入５０．０ ｍＬ丙酮，４０ ℃超声提取３０ ｍｉｎ，过滤；滤液挥干，用５０％乙腈水溶液定容于５０ ｍＬ容量瓶。过０．２２ μｍ有机微孔滤膜后，在设定的液相－质谱条件下检测。
１．２．２ 标准品制备 精密称取柠檬苦素标准品１．５０ ｍｇ，用１０ ｍＬ乙腈溶解后，超纯水定容至２５．０ ｍＬ。制得柠檬苦素６０．０ ｍｇ／Ｌ浓度的标准对照母液。分别取柠檬苦素标准母液０．０５、０．１０、０．５０、１．００、２．００ ｍＬ，用５０％的乙腈水溶液定容于１０．０ ｍＬ容量瓶中，得到柠檬苦素０．３０、０．６０、３．００、６．００、１２．００ ｍｇ／Ｌ的标准工作溶液。
１．２．３ 色谱条件 ＡＣＱＵＩＴＹ-ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８色谱柱（２．5 mm×５０ ｍｍ，１．9 μｍ），柱温４０ ℃，流速０．３ ｍＬ／ｍｉｎ，进样５ μＬ。流动相为水与乙腈梯度洗脱，乙腈梯度为１０％（０ ｍｉｎ）－５０％（３ ｍｉｎ）－１０％（４ ｍｉｎ）－１０ ％（５ ｍｉｎ）。
１．２．４ 质谱条件 毛细管电压３．２ ｋＶ，锥孔电压４０ ｋＶ，离子源温度１１０ ℃，脱溶剂气温４００ ℃，锥孔气流量５０ Ｌ／ｈ，脱溶剂气流量８００ Ｌ／ｈ。离子化模式为大气压电喷雾离子源正离子模式（ＥＳＩ＋），碰撞池电压（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｖ）３０ Ｖ，碰撞氩气流速０．１４ ｍＬ／ｍｉｎ。采用多反应监测（ＭＲＭ）方式。
１．２．５ 标准曲线制备 在仪器设定的色谱－质谱条件下，进标准梯度溶液各５．０ μＬ，ＭＲＭ检测柠檬苦素母离子ｍ／ｚ＝４７１．１，定性离子ｍ／ｚ＝４２５．３，定量离子ｍ／ｚ＝１６１．１。以定量离子ｍ／ｚ＝１６１．１峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。
１．３ 试验方法学评价
１．３．１ 精密度试验 取柑橘同一部位材料样品，按１．２．１方法制备样品，在色谱－质谱条件下平行测定５次，每次进样５ μＬ，测定柠檬苦素的峰面积，计算相对标准偏差（ＲＳＤ），考察方法的精密度。
１．３．２ 重复性试验 取柑橘同一部位材料样品，按１．２．１方法平行制备５个样品，在色谱－质谱条件下测定，每个样进样５ μＬ，测定柠檬苦素的峰面积，计算相对标准偏差（ＲＳＤ），考察方法的重复性。
１．３．３ 稳定性试验 取柑橘同一部位材料样品，按１．２．１方法平行制备５个样品，在色谱－质谱条件下测定，分别于０．５、１、６、１２、２４ ｈ进样５ μＬ，检测柠檬苦素的峰面积，计算相对标准偏差（ＲＳＤ），以考察方法的稳定性。
１．３．４ 回收率试验 精密量取已测定柠檬苦素为2 500 mg/kg的柑橘各部位样品０．２ ｇ，加入６０．０ ｍｇ／Ｌ的标准对照母液３．０ ｍＬ（１８０ μｇ），按１．２．１方法制备样品，在色谱－质谱条件下平行进样３次，每次进样５ μＬ，以标准曲线计算其含量，通过加标回收率公式计算各样品的回收率。
１．３．５ 定量限试验 将含柠檬苦素０．１２ ｍｇ／Ｌ的标准溶液逐级稀释，在液相质谱分析条件下进样分析，以ＲＳ/Ｎ＝１０ 确定柠檬苦素的定量限。
２ 结果与分析
２．１ 标准曲线的确定
试验标样的色谱－质谱图见图１，以标准溶液浓度为横坐标，定量离子ｍ／ｚ＝１６１．１峰面积为纵坐标，拟合标准工作曲线，得到柠檬苦素线性回归方程：ｙ＝６２０．７８ｘ＋８０．２４，其相关系数ｒ＝０．９９８ ７。该检测条件下，柠檬苦素在０．３０～１２．００ ｍｇ／Ｌ之间线性关系良好。
２．２ 方法学评价
２．２．１ 精密度试验 在色谱－质谱条件下，按精密度试验方法测得柑橘茎样品（柠檬苦素含量３．９２ ｍｇ／Ｌ）的柠檬苦素峰面积分别为２ ５６８．１２、２ ５１３．４５、２ ４５６．２３、２ ５９８．６４、２ ４１０．５５，计算得到其相对标准偏差（ＲＳＤ）为３．０９％。同理测得柑橘其他部位样品的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为：柑橘叶２．８４％、花２．３１％、皮３．３６％、果肉４．０８％、橘络２．１７％、橘子１．９５％，不难看出，在所有精密度试验中，相对标准偏差（ＲＳＤ）都小于５％，表明在该条件下采用的方法精密度良好。
２．２．２ 重复性试验 在色谱－质谱条件下按重复性试验的方法测得平行处理的５个柑橘茎样品中柠檬苦素的峰面积分别为２ ６１２．２３、２ ５４８．８７、２ ５７９．６９、２ ４５８．６３、２ ４１１．７６，计算得其相对标准偏差（ＲＳＤ）为３．３３％。同理测得柑橘其他部位样品的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为柑橘叶２．７７％、花２．４１％、皮３．１３％、果肉４．５８％、橘络２．３７％、橘子２．２５％。所有部位的相对标准偏差（ＲＳＤ）都小于５％，表明在该条件下采用的方法重复性良好。
２．２．３ 稳定性试验 在色谱－质谱条件下按稳定性试验方法，测得柑橘茎样品柠檬苦素的峰面积分别为２ ６２５．１１、２ ５９３．２１、２ ４１３．１６、２ ５１１．８４、２ ５３５．５３，计算得其相对标准偏差（ＲＳＤ）为３．２３％。同理测得柑橘其他部位样品的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为柑橘叶３．１７％、花２．６４％、皮３．３５％、果肉４．３２％、橘络２．６７％、橘子２．１９％。所有部位的相对标准偏差（ＲＳＤ）都小于５％，表明在该条件下采用的方法使样品稳定性良好。
２．２．４ 回收率试验 精密量取已测定柠檬苦素为２ ５００ ｍｇ／ｋｇ的柑橘花样品０．２ ｇ，加入１８０ μｇ柠檬苦素标准物质，按样品制备方法平行制备样品３份，在色谱－质谱条件下测定添加标准品后的柠檬苦素含量，计算柠檬苦素的回收率，结果见表１。从表１可见，该分析方法的平均回收率为１０３．６％，表明该方法的准确性良好；回收率的ＲＳＤ为３．８０％，小于５ ％，表明该回收率试验的稳定性，重复性良好，检测方法结果可信。用同样的方法测得橘叶的柠檬苦素平均回收率为９９．１％，ＲＳＤ为４．１５％；橘茎的柠檬苦素平均回收率为９９．３％，ＲＳＤ为４．０３％；橘皮的柠檬苦素平均回收率为９９．１％，ＲＳＤ为４．２３％；橘络的柠檬苦素平均回收率为１０２．３％，ＲＳＤ为３．７８％；橘子的柠檬苦素平均回收率为１０３．８％，ＲＳＤ为３．１５％；橘果肉的柠檬苦素平均回收率为９８．１％，ＲＳＤ为４．８７％。所有部位的相对标准偏差（RSD）都小于5%，表明在试验条件下采用的方法使样品测定结果可信。
２．２．５ 定量限试验 定量限试验结果显示，在液相－质谱分析条件下进样分析，得到RＳ/Ｎ＝１０，计算得到柠檬苦素的定量检测限为２．８ ｎｇ／ｍＬ。
２．３ 样品中柠檬苦素分析结果
依样品制备方法和测定条件，对柑橘样品中的柠檬苦素质量分数实施测定，得到橘花的结果见图２、所有部位的结果见表２。从图２、表２可见，柑橘中的苦味物质柠檬苦素主要分布在柑橘子（３ ２００ ｍｇ／ｋｇ）、柑橘花（２ ５００ ｍｇ／ｋｇ）、橘络（１ ７８０ ｍｇ／ｋｇ）中；柑橘皮、茎、叶中的柠檬苦素含量较低，并且三者含量大体相当；以柑橘果肉的柠檬苦素含量（２２０ ｍｇ／ｋｇ）最低。
３ 讨论
现在关于柑橘中苦味物质的研究越来越多，主要集中在柑橘加工业中产品脱苦和柑橘苦味物质的药用价值两个方面［１７－１９］。前人研究证明，柑橘中苦味物质有各种各样的生理活性和药理功效，如抗癌、消炎等，开发利用柑橘中的柠檬苦素将有效提高柑橘的综合利用价值，延长柑橘的产业链。
试验结果显示，柑橘的苦味物质主要存在于柑橘的子、花和橘络中，因此在柑橘加工前的整理过程中为避免苦味，应尽量剔除橘络和橘子，并且橘皮也要剔除，这将有效降低加工过程的苦味物质脱除成本。而对于提取柑橘中的柠檬苦素而言，最好的原料是橘子和橘花，材料来源最丰富的是橘皮、橘叶、橘茎。
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（责任编辑 王珞）