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雪莲中绿原酸、芦丁、木犀草素含量的HPLC法测定

  • 投稿韩东
  • 更新时间2015-09-22
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张海霞1,卢永昌2,王 庶1

(1.青海民族大学化学与生命科学学院, 西宁 810007;2.青藏高原植物资源化学重点实验室,西宁 810007)

摘要:建立测定雪莲(Saussurea involucrata)中绿原酸、芦丁和木犀草素含量的方法,采用HPLC法,色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),乙腈-0.8%磷酸水溶液进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长360 nm,柱温30 ℃。绿原酸、芦丁、木犀草素的线性范围分别为0.081~0.408 μg/mL、0.090~0.449 μg/mL、0.045~0.224 μg/mL;平均加样回收率分别为99.78%、99.89%、100.70%,其中绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高,木犀草素在苞叶雪莲中含量最高。

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关键词 :高效液相色谱法(HPLC);雪莲(Saussurea involucrata);绿原酸;芦丁;木犀草素

中图分类号:R284.2;S567 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2015)02-0434-03

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.045

雪莲(Saussurea involucrata)又名雪荷花,为菊科(Asteraceae)凤毛菊属(Saussurea)植物,珍稀名贵中药材,常见的有苞叶雪莲、水母雪莲、天山雪莲、唐古特雪莲等,主要分布在2 400 m以上的高原寒带地区的青海、新疆、甘肃、四川、西藏等地。雪莲性温、微苦,祛风除湿,通筋活血,暖宫散瘀效果显著。此外,对风湿性疾病具有特殊效果,还具有抗炎镇痛、止血消肿之功效,使用安全,无明显的不良反应[1-3]。药理研究显示芦丁、木犀草素和绿原酸为雪莲中的主要抗肿瘤抗癌有效成分[4-6]。对于芦丁、木犀草素和绿原酸在雪莲中的含量同时分析测定尚未见报道。为有效控制雪莲药材质量,本试验采用微波提取法对雪莲中芦丁、木犀草素和绿原酸进行提取,采用高效液相色谱法对芦丁、木犀草素和绿原酸的含量进行了测定,并比较了不同种雪莲药材3种物质的含量差异。该方法快速、简便、准确、重复性好,为雪莲药材的进一步研究和综合开发利用提供参考

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雪莲系2012年8月采自青海、新疆(经高原生物研究所胡凤祖副研究员鉴定)。

Agilent 1200型高效液相色谱仪,包括G1311A四元输液泵,G1316A柱温箱,G1329A自动进样器,G1315A二级管阵列(DAD)检测器,Agilent1200色谱工作站。

1.2 试验试剂

芦丁标准品(中国药品生物制品检定所,批号:100080-200707)、绿原酸标准品(中国药品生物制品检定所,批号:110753-200212)和木犀草素标准品(中国药品生物制品检定所,批号:111520-200504);乙腈,甲醇为色谱纯,磷酸为分析纯;水为超纯水。

1.3 色谱条件

色谱柱采用Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm); 流动相乙腈(A)-0.8% 磷酸水溶液(B) ,梯度洗脱(0~8 min,10%~15% A;8~12 min,15%~30%A;12~35 min,30%~32% A);检测波长360 nm;流速为1.0 mL/min;进样10 μL,柱温30 ℃。

1.4 溶液的配制

1.4.1 标准品溶液制备 分别精密称取绿原酸 10.20 mg、芦丁 11.23 mg、木犀草素5.60 mg,置于 50 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,配成质量浓度分别为204.0、224.6、112.0 mg/L的标准品储备液。

1.4.2 供试品溶液的制备 精密称取雪莲药材粉末1.30 g,置具塞锥形瓶中,精密加入纯甲醇40 mL,超声波处理2 h,冷却,再称定重量,用纯甲醇补足减失重量,0.45 μm微孔滤膜过滤即得。 

2 结果与分析

2.1 系统适应性试验

分别吸取标准品溶液和供试品溶液,按“1.3”的色谱条件,分别进样10 μL,记录色谱图。结果表明在此色谱条件下,绿原酸、芦丁、木犀草素分离良好,分离度均大于1.5,且理论塔板数均不低于4 000,结果见图1至图4。

2.2 线性关系考察 

精密吸取上述标准品储备液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,置于50 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度摇匀,配成系列质量浓度的标准品溶液。取10 μL进样后记录峰面积,以质量浓度(μg/mL)为横坐标(X),以峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到绿原酸、芦丁、木犀草素的回归方程。

绿原酸:Y=12 316X+99.5(r=0.999 9)

芦丁:Y=11 276X+246.5(r=0.999 7)

木犀草素:Y=22 277X+20.8(r=0.999 5)

结果表明,绿原酸、芦丁、木犀草素分别在0.081~0.408、0.090~0.449、0.045~0.224 μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.3 稳定性试验 

用自动进样器依次对同一供试品溶液进样,在1、 2、3 d后分别进样10 μL,以峰面积计算。结果表明,绿原酸的RSD为1.23%,芦丁的RSD为1.35%,木犀草素的RSD为1.30%,供试品溶液在3 d内稳定。

2.4 精密度试验 

按“1.3”的色谱条件,绿原酸,芦丁和木犀草素的标准品溶液各进10 μL,每种溶液测定6次,记录峰面积,绿原酸RSD为0.88%,芦丁RSD为1.18%,木犀草素RSD为1.22%,表明进样精密度良好。

2.5 重复性试验 

精密称取水母雪莲粗粉(过100目)6份,按“1.4.2”制备样品溶液,用“1.3”的色谱条件,进样分析,记录峰面积,绿原酸的RSD为0.89%(n=6),芦丁的RSD为0.89%(n=6),木犀草素的RSD为1.11%(n=6)。

2.6 加样回收试验

取已知绿原酸、芦丁和木犀草素含量的雪莲9份,分别在上述9份药材中加入绿原酸的标准品溶液(0.204 mg/mL)、芦丁标准品溶液(0.225 mg/mL)和木犀草素标准品溶液(0.112 mg/mL),按“1.4.2”制得供试品溶液,分别进样10 μL,记录雪莲中绿原酸、芦丁和木犀草素的峰面积,计算含量,并计算回收率,结果见表1。

2.6 样品测定

按“1.3”的色谱条件,分别精密称取3种雪莲药材粉末各1 g,按上述方法测得绿原酸质量分数为0.132 1%~0.193 3%,平均为0.160 7%(n=8);芦丁质量分数为0.113 4%~0.202 2%,平均为0.171 2%(n=8);木犀草素质量分数为0.020 4%~0.058 2%,平均为0.036 1(n=8),其中绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高,木犀草素在苞叶雪莲中含量最高(表2)。

3 小结与讨论 

雪莲中所含成分复杂,其理化性质相差较大,表现出较大的色谱行为差异。目前文献报道的多组分含量测定方法不甚理想,多有拖尾现象。考虑到绿原酸与芦丁2组分均具酸性,笔者通过调节流动相的pH,以抑制样品组分的解离,较好地改善了峰形[7]。同时,三者的极性差异较大,为了使各组分有较好的分离效果,采用梯度洗脱技术[8,9]。先后使用不同比例的甲醇、甲醇-磷酸、乙腈、乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸等,分离效果均不显著,分离度不达标,采用乙腈-0.8%磷酸水溶液梯度洗脱后,拖尾情况有较好改善,图谱特征性增强,目标峰的峰型和分离度均较好,故选择乙腈-0.8%磷酸水溶液为流动相[6],用于梯度洗脱。

通过对3种雪莲样品中3种药效化合物的含量进行测定,结果表明,不同种雪莲有效成分含量有差异:木犀草素在苞叶雪莲中含量最高;绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高。可见,品种基因影响了药材有效成分的积累,根据有效成分的含量确定药材的品种是非常必要的,为今后雪莲的开发应用提供了必要的信息。

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(责任编辑 龙小玲)