张卫丽1，2 韩雅莉3
（1.广州大学市政技术学院，广东 广州 510880；2.广州市市政职业学校，广东 广州 510500；
3. 广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510500）
【摘 要】采用了机溶剂提取法，研究了溶剂种类、提取时间、料液比单因素进行提取马尾松松针有效物质，并探究了提取物抗氧化性，结果表明其对DPPH有较高的清除效果，对羟基自由基的清除不具稳定性。
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关键词 马尾松；提取；抗氧化性
0 前言
马尾松属松科植物， 是我国亚热带地区分布最广、 资源最大的树种松针营养丰富，资源富足，价格低廉，国内松针的工业应用发展很快。目前国内松针的产品主要运用在饲料添加剂、食品、医药、日常生活用品中，如松针粉、松针浸膏、松针叶绿素-胡萝卜素-软膏、粉状松针膏饲料添加剂、松针饮料、松针茶等等。有机溶剂浸提松针得到的浸膏，其可作为功能性肥皂、牙膏等的添加剂，也是松针食品、药品、化妆品研发的活性源料成分。本文初步探讨松针有机溶剂浸提物的抗氧化性，其为在医药、食品、环境方面的应用提供一定的导向。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
马尾松； 1，1-二苯基-2-苦基肼、邻二氮菲、硫酸亚铁、EDTA、双氧水、氮蓝四唑、核黄素、甲硫氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾，氯化钠、氯化钾、电子分析天平、SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵; RE- 5298A 旋转蒸发仪、电热恒温水浴锅、UV-1800紫外可见分光光度计。
1.2 实验方法
1.2.1 提取物的制备
取新鲜松针5g粉碎置于圆底烧瓶中，加入一定量的溶剂，水浴加热回流提取，减压浓缩至20mL，得马尾松提取物。
提取工艺的选取：采用有机溶剂回流提取松针，进行了溶剂种类、提取时间、料液比单因素实验；
1.2.2 松针提取物抗氧化性能测定
待测液的制备：取待测提取物浓缩液20μL，50μL，100μL分别加蒸馏水配制成1mL。
1）DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼）的测定
DPPH溶液的制备：用70%乙醇配制成0.2mM的DPPH溶液。
提取物DPPH清除率的测定[1-2]
取制备好的待测液，分别加入2.0mL 0.2mM的DPPH溶液，充分混匀，室温下在黑暗处静置培养30min，采用分光光度法，在517nm处检测吸光度As。加入松针提取物以外的所有试剂，按照测定As的方法测定A0。加入DPPH以外的所有试剂，测定Ac。
2）羟基自由基清除率的测定[3]
取5mM邻二氮菲溶液0.6mL，依次加入0.4mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，0.6mL硫酸亚铁溶液，0.6mL EDTA溶液，1.4mL蒸馏水，1mL样品溶剂，混合均匀，37℃保温1h，536nm处测定吸光度值A空白。
取邻二氮菲溶液0.6mL，依次加入0.4mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，0.6mL硫酸亚铁溶液，0.6mL EDTA溶液，0.6mL蒸馏水，1mL样品溶剂，0.8mL 0.1％双氧水，混合均匀，37℃保温1h，536nm处测定吸光度值A损伤。
样品制备方法同上，将损伤液配制中的1mL样品溶剂换成1mL样品。混合均匀后，37℃保温1h，536nm处测定吸光度值A样品。
3）超氧阴离子的测定[4-5]
参考GhiselliA和沈文飚等人的检测方法，并对方法加以调整。试管内依次加入0.5mL 0.2MpH7.8的PBS溶液，0.3mL5×10-5M核黄素，0.25mL 13mM甲硫氨酸，0.25mL 5.1×10-4M氮蓝四唑，0.7mL 0.1mM的EDTA， 1 mL样品溶剂，再加入蒸馏水，定容到4mL，40W日光灯照射于560nm处测定空白样的吸光度值A空白。将测定A空白时的样品溶剂换成不同浓度的样品溶液，测定样品的吸光度值A样品。
2 结果与讨论
单因素提取实验抗氧化性研究：
2.1 溶剂种类
1）DPPH自由基清除效果
70%乙醇、60%丙酮的提取物对DPPH自由基具有较的的清除效果，其在选取的浓度范围内，增加提取物浓度对DPPH自由基清除率影响不大。
2）羟基自由基清除效果
70%乙醇的提取物对羟基自由基清除效果差，60%丙酮、乙酸乙酯两种溶剂的提取物对羟基自由基清除效果相对强些。
3）超氧阴离子清除效果
为溶剂种类对松针提取物清除羟基自由基的影响。三种溶剂中，70%乙醇、60%丙酮的提取物清除效果强些。总体上，提取物浓度对超氧阴离子清除效果影响不明显，三种溶剂的提取物对超氧阴离子都有一定的清除作用。
2.2 提取时间
料液比1：30，根据前面的实验，选取70%乙醇为提取溶剂，对提取时间因素进行研究，同时，在选取提取物浓度的研究范围内，提取时间因素对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子的清（下转第21页）（上接第12页）除效果有不同的结果。结果表示：提取时间因素对DPPH自由基、超氧阴离子的清除效果影响不明显；松针提取物对DPPH自由基清除效果强些；对羟基自由基的清除效果不稳定。见图1。
2.3 料液比
通过上述实验探索，选取提取溶剂70%乙醇、提取时间1.5h的条件对料液比因素进行研究。由图2可知，提取物的抗氧化能力：对DPPH自由基、羟基自由基的清除效果与提取时间影响因素的结果大体一致；对超氧阴离子清除效果在提取物加样容量为20微升时，清除效果不受料液比因素的影响。当取物加样容量为50微升、100微升时，在料液比1：40的条件下，清除效果最弱，其它料液比的条件下，清除效果几乎不明显。整体上，提取物对DPPH自由基清除效果好。
3 结论
（1）对DPPH自由基清除能力：溶剂回流工艺得到的松针提取物对DPPH自由基有较高的清除效果。提取时间、料液比的影响因素对此自由基清除能力影响不明显。
（2）对羟基自由基清除能力：提取物对羟基自由基清除能力不稳定，可能是提取物内的有效成分性质不稳定，易发生变化。
（3）对超氧阴离子清除能力：提取物对超氧阴离子具有一定的清除能力。本实验研究的影响因素及提取物的浓度几乎对超氧阴离子清除能力无影响。
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参考文献
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［责任编辑：刘展］