摘 要：
细胞与胞外基质相互作用产生的主动作用力叫牵引力，对这个力进行表征需要用细胞牵引力显微镜技术（traction force microscope,TFM），该技术主要是通过测量细胞外弹性基质的变形得到形变场，再通过反演算法重构细胞所产生的牵引力，为许多牵引力失衡所导致的疾病（如癌症、组织纤维化、动脉粥样硬化等）的机理探究、诊断与治疗提供重要的理论支撑和检测手段。该文将这一带有鲜明力学与生物学交叉特色，且具有巨大实际应用前景的先进实验技术引入了生物力学实验教学，并适配了相应的实验内容、实验流程及课程安排。
关键词:细胞牵引力显微镜技术;前沿实验,实验教学;
Design of multi-disciplinary mechanobiology experimental teaching project based on
traction force microscopy
DU Shuyuan XU Yue GUO Chuanwen
YANG Chun
School of Aerospace Engineering,Tsinghua University National Demonstration Center for
Experimental Mechanics Education, Tsinghua University School of Life sciences,Tsinghua
University
Abstract：
Traction force, an active force generated by interaction between cell and extracellular matrix, which required TFM for characterization. Based on the strain field obtained by measuring substrate deformation data,traction force can be retrieved using inversion algorithms, providing important theoretical support and detection means for mechanism exploration, diagnosis and treatment of many diseases caused by traction force imbalance(such as cancer, tissue fibrosis, atherosclerosis, etc.). This experiment introduces this advanced experimental technology with distinct features of integration of biology and mechanics into the biomechanics experimental teaching. The corresponding experiment content, experiment steps and course arrangement are also adapted.
Keyword：
traction force microscopy; advanced experiment; experimental teaching;
1 课程设计的背景与思路
力学和生物学、医学的深度交叉是当今世界的前沿、热点研究方向。生命的基本单位是细胞，细胞一般生活在细胞外基质所形成的微环境中，细胞通过黏着斑等结构实现细胞贴壁，并将细胞骨架产生的力传递到胞外基质[1]，这种细胞与胞外基质之间的作用力，叫做牵引力，是细胞与胞外基质交互而产生的主动的作用力[2,3]。目前表征该力常用的方法是细胞牵引力显微镜技术（traction force microscope,TFM），该技术是数字散斑技术（digital image correlation,DIC）在细胞检测中的延伸应用[4]。基本原理是将细胞培养在弹性模量已知且预先有荧光示踪粒子标记的弹性基底（如聚丙烯酰胺凝胶[5]）上，当细胞收缩时会牵引胞外基底产生变形，细胞所施加的这种机械力与基底的变形符合弹性力学基本假设，利用激光共聚焦显微镜记录荧光示踪颗粒的位移变化，即可得到基底的弹性变形情况[6,7]，最终通过反演算法就能得到细胞在弹性基底表面施加的牵引力数据[8,9]。得益于物理、化学、电子、生物等多个领域的巨大进步和深度交叉，细胞牵引力显微镜技术近年来进入了研究和突破的高速发展期[10]。该技术对于研究细胞周围微环境对细胞的贴壁、迁移、生长分化等生理学功能的影响有极大帮助[11,12]。
我们尝试在生物力学实验课中引入该技术，用两次课共8学时，系统介绍该技术的发展史、基本原理、测量方法、反演算法、软件使用、数据处理等内容，并进行实操。课上要求学生理解原理和算法，熟悉实验操作流程，课后要求他们独立完成探索性研究型实验报告。该报告类似一个小型科研论文，要求学生在充分调研文献的基础上，根据自己的兴趣和发现，利用该技术完成一项完整规范的科学探究，或者对该技术本身提出有效的改进与建议。
2 实验仪器用具与试剂
实验仪器：超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A，上海一恒科技有限公司）；移液器（Eppendorf）；超纯水机（Labonova Smart）；四周振荡摇床（MS3,IKA）；涡旋震荡仪（Corning）；灭菌锅（MLS-3750，三洋）；超净工作台（BCN1360，北京东联哈尔）；恒温CO2细胞培养箱（HF90，上海力申）；–80℃超低温冰箱（Thermo);4℃及–20℃冰箱（海尔）；激光共聚焦显微镜（Nikon）。
实验用具：共聚焦培养皿（内径20 mm）；圆形盖玻片（直径18 mm）；离心管；镊子；三角瓶；烧杯；洗耳球等。
实验试剂：Na OH（国产分析纯）；无水乙醇（国产分析纯）；亲和硅烷APTES(Sigma）；戊二醛（国产分析纯）；丙烯酰胺（40%w/v，拜尔迪）；N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（2%w/v）；拜尔迪)；过硫酸铵（10%w/v，拜尔迪）；TEMED（拜尔迪）；直径200 nm表面羧基修饰的荧光微球（Sigma);Sulfo-SANPAH(1 m M,Proteo Chem);HEPES(50 m M,Sigma);Type I collagen (0.2 mg/m L，实验室自制)；PBS(Corning);DMEM-High Glucose Medium(Corning）；胎牛血清（Gibco）；链霉素及青霉素（Ameresco）；胰蛋白酶（Sigma）。
实验材料：小鼠成纤维细胞（NIH3T3）。
3 实验项目设计原理
牵引力显微镜技术基本原理如图1所示。细胞自主收缩使胞外弹性基底产生形变，基底变形会使其表面荧光示踪颗粒的位置发生变化，用激光共聚焦显微镜分别采集记录弹性基底上有细胞牵引时的荧光图片和消化细胞后松弛状态时的荧光图片[13]，再通过图像处理技术比较两幅荧光图像的差异，就能得到荧光示踪颗粒的位移场[14,15]。
用计算机处理得到荧光颗粒产生的位移场后，通过相应的程序处理就可以反演得到细胞表面的牵引力，具体流程如图2所示。
4 适配实验课程教学的内容优化
将前沿的实验技术引入实验课教学，首先要降低实验操作难度、提高复现性。为了在有限的课堂时间内完成所有的实验操作，有些步骤可以在课前预先做好。
4.1 实验流程与细节优化
我们对实验体系进行了合理优化（见表1):(1)选择杨氏模量为8.73 k Pa的聚丙烯酰胺凝胶作为基底材料，该材料本身具有诸多特点，非常适合作为测量细胞牵引力的基底，且大部分细胞都能拉动该硬度的弹性基底；(2)基底中包埋直径为200 nm的荧光颗粒，使其通过重力沉降方式聚集在聚丙烯酰胺凝胶表面；(3)成像系统选择激光共聚焦显微镜代替普通荧光显微镜，以提高分辨率和实验成功率；(4)细胞选择小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3，该细胞接种成活率高，方便学生进行细胞牵引力测量操作；(5)经过位移场采集和应力场反演，取正则化参数（2×106）获得的牵引力；(6)实验课分成两次，每次4学时，共8学时，第一次课进行技术原理讲解和胞外基底制备，第二次课采集图像并用软件计算反演力场。
4.2 优化后的实验步骤
4.2.1 第一次课，PA胶基底制备
在经表面化学处理的盖玻片上制备聚丙烯酰胺凝胶，凝胶内掺杂荧光小球颗粒，凝胶表面修饰细胞外基质蛋白。具体步骤如下（见图3）。
课前，准备好干净的共聚焦培养皿和盖玻片。用超声清洗仪清洗共聚焦培养皿和圆形盖玻片20 min，烘干后待用。在共聚焦培养皿中加入1 M Na OH浸泡处理，过夜后加入dd H2O（双蒸水），用脱色摇床振荡清洗10 min，共3次。之后再加入无水乙醇，用脱色摇床振荡清洗10 min。
课前，用亲和硅烷和戊二醛处理培养皿玻璃表面。用无水乙醇配置0.5%(v/v）亲和硅烷，加入共聚焦培养皿中，室温孵育10 min，之后直接加入dd H2O继续孵育30 min。吸出全部液体后，再用dd H2O振荡清洗3 min。接着加入0.5%戊二醛室温孵育30 min，使玻璃表面均匀排布醛基，吸掉液体后吹干待用。
课上，制备含荧光颗粒的聚丙烯酰胺水凝胶。学生按表2的比例配置好聚丙烯酰胺水凝胶溶液，并混入0.2%(v/v）的荧光颗粒，涡旋振荡混匀，再加入催化剂过硫酸铵和TEMED。取10µL水凝胶溶液滴在经表面处理的共聚焦平皿表面，在上方覆盖玻片，使聚丙烯酰胺溶液形成一层薄膜，迅速倒置培养皿，以免溶液聚合成凝胶，保证荧光颗粒在溶液聚合成凝胶前，能够依靠重力沉降到凝胶表面，即接触细胞的一面。30 min后，聚丙烯酰胺水凝胶聚合，dd H2O浸泡5 min，揭去覆盖在表面的盖玻片。
在聚丙烯酰胺凝胶表面交联细胞外基质蛋白。在避光条件下，用2 m L HEPES (50 m M,p H=8.5）溶解sulfo-SANPAH（浓度为1 mg/m L），每皿加入250μL，再通过紫外照射15 min将其活化。用HEPES洗3遍后，每皿加入200μL 2μg/m L type I collagen醋酸溶液，4℃过夜。紫外灯下照射30 min消毒后，接种细胞。
4.2.2 第二次课，采集图像并用软件计算反演力场
具体实验操作如下：
(1）预先将细胞接种在制备好的弹性基底上，培养适当时间，使其贴壁。
(2）用激光共聚焦显微镜采集细胞及基底内荧光颗粒分布图像。
(3）用1 m L 1 M的Na OH消化细胞，使细胞与基底脱黏，使基底松弛，再次采集荧光颗粒分布图像，此时要选好合适的参考点，以尽量减少图像刚体位移。
(4）利用MATLAB计算荧光颗粒位移场。反演基底表面应力场，分析细胞牵引力。具体步骤如下：(1)将激光共聚焦显微镜采集到的细胞消化前后的荧光颗粒图像导入MATLAB，采用Danuser Lab的TFM开源程序；(2)程序对两张荧光颗粒图像进行互相关计算，取数字图像相关系数峰值处的坐标值对荧光图像进行去除刚体位移处理，以消除消化细胞等实验过程中可能存在的弹性基底刚体位移，减小荧光颗粒位移场计算的误差；(3)计算荧光颗粒位移场。Danuser Lab程序包使用的是追踪区域图像相关的方法，将荧光图像划分为许多小区域，比对两张图像中每个小区域内的荧光颗粒位置，进而得到小区域的位移场，并插值得到荧光颗粒位移的连续场。鉴于弹性基底形变会导致荧光颗粒位移，细胞消化前后两张图像中对应小区域内的荧光颗粒数量可能不相同，对位移场计算引入误差。为减小甚至消除此误差对实验结果的影响，可对程序进行改进，将追踪区域图像相关改为追踪颗粒图像相关。首先设置一个荧光颗粒位移的最大值（通过实验条件与细胞状态自行判断），在第二张图像中追踪第一张图像内每一个荧光颗粒可能对应的位点，结合荧光颗粒的唯一性最终得到每个荧光颗粒位移的离散场，并插值得到连续场。基于弹性力学半无限大空间表面受集中力的Boussinesq解，由荧光颗粒位移场反演可得到牵引力场。
(5）完成实验报告。要求详细记录实验原理、实验流程、实验结果，并对实验结果进行分析和讨论。
4.3 可视化实验结果
激光共聚焦显微镜下采集到的图像如图4所示。随后用MATLAB程序对荧光颗粒图像进行牵引力反演[4]，通过调节相关参数得到最佳的牵引力场图，结果见图5（图中黄线为勾勒出的细胞边界）。
前面提到，细胞牵引力是由细胞骨架收缩而产生、通过黏着斑传递到胞外基质的。显然，牵引力应该局限在施力物体——细胞周围，更进一步地，应该集中在黏着斑附近。这也为我们判断最佳牵引力场提供了判据，即反演得到的牵引力场应分布在黏着斑附近或细胞周围。由于程序使用了基于弹性力学Boussinesq解的反演算法，其本身属于一个病态反问题，需要引入正则化参数（regularization parameter）以使得到的结果更加逼近真实解。
正则化参数表征的是为达到相同位移场所需要的力的数量，正则化参数越小，则需要的力越多，同时力的作用面积越小，表现为牵引力场越“零碎”、越“锐化”。由图5可以看出，随着正则化参数的减小，牵引力热图越锐化，牵引力数值越大。结合黄色的细胞轮廓与细胞牵引力产生的原理，不难看出正则化参数为2×10–6时反演得到的牵引力场为最佳牵引力场。
5 结语
通过实验条件优化改进及相应的课程安排，学生都能够接受和完成课程设置的挑战度。生物学专业背景学生在没有力学专业背景情况下，也能够理解通过图像处理识别位移场的原理，以及位移场反演得到牵引力场的定性原理，学会使用MATLAB程序完成数字图像处理工作，进而反演获得牵引力场。而力学专业背景的学生在没有细胞实验技能的情况下，能够学会在自行制备且经化学修饰过的水凝胶胞外基质上培养细胞，学会使用共聚焦显微镜采集细胞荧光图像。学生在实际操作上有明显进步，还能通过查阅相关文献找到自己感兴趣的科研问题，并利用该实验技术进行实验探究，在理论和思维上接触到了交叉学科的前沿领域。
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