李秀丽，白 音，刘志杰，刘青妍，周家乐，李林晔，吴传昊，赵燕星，郑晓敏
（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000）
摘 要：目的：研究槲皮素对NAFLD大鼠血清SOD活力和MDA含量的影响.方法：SD大鼠高脂饮食8周形成NAFLD模型，槲皮素低、中、高剂量(100、200、300mg/kg)干预4周,肝脏HE染色观察NAFLD模型大鼠肝脏病理改变，计算肝湿重和肝指数，检测血清和肝脏的甘油三酯(TG)、血清转氨酶（ALT、AST）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白胆固醇（HLD-c）水平；进行肝组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的测定.结果：与模型组相比,槲皮素中、高剂量组大鼠体重、肝湿重、肝指数降低，血清TG、TC、LDL-c、ALT、AST显著下降，而HLD-c无变化；肝脏HE染色显示脂质沉积减轻；SOD显著升高，MDA显著下降.结论：槲皮素剂量依赖性地改善NAFLD，其机制可能与上调SOD和下调MDA有关.
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关键词 ：槲皮素；非酒精性脂肪性肝病；脂质代谢；氧化应激
中图分类号：R575文献标识码：A文章编号：1673-260X（2015）08-0064-03
基金项目：内蒙古自治区自然科学基金项目（2013MS1115）； 内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZC13316）；赤峰学院重点实验室建设项目资助
非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver diseases, NAFLD）是一种进展性疾病.发病机制不清，1998年Day和James提出的“二次打击”学说现已成为解释NAFLD发生机制的主要理论.“第一次打击”主要是指胰岛素抵抗（IR）和脂代谢紊乱所导致的肝细胞脂质沉积，形成单纯性脂肪肝，而在此基础上发生的氧化应激、脂质过氧化损伤成为NAFLD发病中的“第二次打击”[1]，这些因素可以使脂肪变性后的肝细胞更易受到损伤进一步出现炎症，而发展成为非酒精性脂肪性肝炎.笔者在前期研究中阐述了槲皮素（Quercetin）通过影响IR和调节脂质代谢对改善脂质堆积细胞模型的改善作用[2-3]，本文在此基础上，进一步研究槲皮素是否通过影响氧化应激改善NAFLD.
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级雄性SD大鼠50只，体重180g～200g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK2012 -0001.动物饲养于赤峰学院医学院药理学教研室动物室，4-5只分笼饲养，自由摄食进水.温度23℃-24℃，湿度40%-45%，12小时明暗交替.
1.2 试剂与药物
甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白胆固醇（HLD-c）、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所.槲皮素购自郑州荔诺生物科技有限公司.
1.3 方法
SD大鼠50只，4-5只分笼饲养，经适应性喂养1周后，随机分为5组：正常对照组（Con）、模型组（Model）、槲皮素低剂量组（QuL，100mg/kg）、槲皮素中剂量组（QuM，200mg/kg）、槲皮素高剂量组（QuH，300mg/kg），每组为10只.Model、QuL、QuM、QuH组各给予高脂饲料（2g胆固醇、10g猪油、0.3g胆酸钠、87.7g普通饲料），建立NAFLD模型，Con组给予普通饲料喂养.各组实验动物皆自由饮水.第8周末从普通饲料组和高脂组各取出一只做病理验证是否成膜.9周开始QuL组、QuM组、QuH组每日上午8:30-9:00定时灌胃，分别给予槲皮素100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg， Con组和mode两组给予蒸馏水4mg/kg,每日一次.槲皮素治疗4周，所有大鼠隔夜禁食12小时后，麻醉后解剖，自腹主动脉取血，离心取血清备用.迅速取出肝组织，用滤纸吸干表面，称重，并取肝右叶组织外侧端一块投入10%的多聚甲醛中固定以利于病理检查.其余肝组织投于液氮中速冻后，置于-80℃冰箱备用.
1.4 观测项目与方法
（1）观察SD大鼠的精神与食欲状态、毛发和活动情况.在全部实验完成后测体重和肝湿重，计算肝指数（肝指数 =肝湿重/体重×100%）；（2）血清ALT、AST、TG、TC,LDL-C、HDL-C指标的测定，采用全自动生化仪检测.（3）肝组织SOD，MDA含量的测定.称取大鼠肝组织200mg，加冰生理盐水2mL后制成10%匀浆，4℃3500r·min离心15min后取上清液，SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA采用硫代巴比妥酸比色分析法，操作步骤按试剂盒说明书.
1.5 统计学处理
用spss13.0软件包进行数据统计.计量资料采用(x±s)表示，两组间实验数据比较采用成组设计的两样本均数t检验,等级资料采用秩和检验.P＜0.05表示差异有显著性.
2 结果
2.1 一般结果
各组大鼠均发育良好.正常组大鼠精神状态、进食与生长正常，活动度好，毛色润泽，皮毛整洁，无死亡.造模期间，高脂组进食正常，毛色偏黄暗淡，体重增加明显，模型组体形增长较给药组快，各组活动度较好，造模期间各组大鼠均未出现腹泻及死亡（表1）.
2.2 肝脏病理染色
第八周末取高脂饲料组和普通饲料组肝脏病理标本，经HE染色显示,形成NAFLD模型.药物干预4周结果，HE染色观察，Con组肝细胞排列整齐,肝小叶规则,细胞呈多边形,中央有大而圆的核,细胞质均匀,肝细胞内无脂滴沉积.Model组肝细胞肿胀,胞质中出现大小不均的脂滴空泡,以大泡性脂肪滴为主,核居边,细胞界限不清.QueL组脂滴空泡有所减少,QueM、QueH剂量组脂滴空泡显著下降(图1).
2.3 槲皮素对大鼠肝脏指数的影响
与Con组比较，Model组大鼠体重增加明显（p＜0.05），肝湿重和肝指数均显著高于Con组(P＜0.05).与Model组相比，喂养4周末时QuL、QuM、QuH组大鼠体重均明显下降(中、高剂量组P＜0.05，低剂量组无统计学意义），肝湿重明显降低(中剂量组P＜0.05，高剂量组P＜0.01，低剂量组无统计学意义)，高剂量组大鼠肝指数明显降低(P＜0.05)，而低、中剂量组大鼠肝指数无统计学意义(P＞0.05)见表1.
2.4 槲皮素对血清、肝组织生化指标的影响
2.4.1 槲皮素对血脂的影响：给槲皮素4周后QuH组、QuM组和QuL组大鼠血清TG、TC与Model组比较均有下降（P＜0.05)，其中QuH组TG显著下降(为P＜0.01)，QuM、QuH组的LDL-c组有下降趋势（P＞0.05)，而对于HDL-C的测定QuH、QuM、QuL组与Model组比较有升高趋势，但没有差异（P＞0.05)，详见表2.通过对肝组织中TG、TC的测定，Model组与Con组比较有显著性差异（P＜0.05).给药组三个剂量组与模型组比较都有所降低（P＜0.05)，其中高剂量组降低胆固醇比较明显，具有非常显著差异（P＜0.01），详见表3.
2.4.2 槲皮素对肝功能的影响：给药4周后，与Model组比较给药组大鼠血清ALT降低（QuL组和QuH组P＜0.05，而QuM组无统计学意义）；QuM组和QuH组大鼠血清AST较Model组降低(P＜0.05，P＜0.01)，而QuL组无统计学意义（表4）.
2.4.3 槲皮素对脂质氧化的影响：与Con组比较，Model组SOD活性显著降低(P＜0.05)，MDA显著升高(P＜0.05).Model组QuM和QuH组大鼠的SOD明显提高（P＜0.05），QuL组无意义.QuM、QuH组大鼠MDA与Model组相比均降低了，呈现非常显著性差异(P＜0.01)，QuL组MDA无显著性意义（表3）.
3 讨论
随着糖尿病和肥胖在世界范围的流行，与之密切相关的NAFLD发病率也在不断提高，正日益成为公共健康问题.尽管目前学者们对NAFLD的病理生理学机制进行了大量研究，但其明确的发病机制和治疗药物现仍然不明确.国内外的学者针对其治疗药物和发病机制进行了广泛的研究.在本研究中，利用高脂饮食诱导形成的非酒精性单纯性脂肪肝模型，槲皮素组与模型组比较能改善高脂饮食诱导的SD大鼠模型的脂质堆积，降低TG和TC水平，降低ATL、AST.其作用机制如何？本研究从氧化应激和抗氧化的两个关键因子入手.
近年来，有关氧化应激发病机制和抗氧化剂在NAFLD发病进程中的防治作用日益引起广泛关注[4].氧化应激、脂质过氧化被认为可能是导致NAFLD并促其发展的最主要因素之一.在病理情况下活性氧（reactive oxygen soecies, ROS）的产生增多，超过抗氧化系统的清除能力出现相对或绝对过剩，其攻击临近组织、细胞产生氧化应激.氧化应激和ROS形成的主要部位，也是ROS打击的首要靶点是肝实质细胞线粒体.线粒体是肝细胞最重要的细胞器之一，是肝脏脂肪酸进行β氧化和三羧酸循环、ATP、ROS形成的主要场所.尽管线粒体能够修复ROS导致的线粒体DNA（mtDNA）的损伤，但由于mtDNA靠近细胞内膜（ROS的产生部位）并缺乏组蛋白和非组蛋白的保护，修复程序不完整，易受细胞内氧自由基侵袭，导致mtDNA碱基对的缺失突变，从而影响肝细胞脂肪代谢[5-6].
在NAFLD时，肝脏脂质沉积使血清游离脂肪酸增多，肝脏摄取更多的游离脂肪酸增加了线粒体β氧化代偿性速度，进而使得ROS产生增加，一方面导致mtDNA损伤加剧，另一方面ROS损伤线粒体呼吸链，阻断呼吸链的任何部位又可导致ROS的增加，增加的ROS进一步增加氧化性脂质堆积，引起更多的脂质过氧化，抑制呼吸链的电子传递，形成一个恶性循环[7].
在氧化应激过程中的丙二醛（MDA）是ROS与细胞膜磷脂的不饱和脂肪酸反应形成的物质，是评价人体氧化应激的一个非常重要的指标.机体存在两类抗氧化系统，其中一类是酶抗氧化系统，包括SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等.抗氧化物质的消耗形成另一个恶性循环，脂肪堆积产生的的ROS等物质能消耗SOD等抗氧化物质，抗氧化物质的减少更易导致ROS对线粒体的损害效应.因此SOD的检测和评价也作为人体氧化应激和抗氧化最常用的另一指标.本实验通过检测MDA和SOD可知机体氧化应激和抗氧化物质的程度.实验结果显示，Model组大鼠血清中SOD活力与Con组大鼠相比明显降低（P＜0.05），MDA含量升高显著（P＜0.05），提示NAFLD的发生与氧应激和抗氧化物质的损伤的程度有关.给药四周后，槲皮素中、高剂量与模型组比较能明显提高SOD（P＜0.05），降低MDA（P＜0.05），说明槲皮素起到了明显的抗氧化作用，并且槲皮素高剂量组大鼠肝脏脂肪变化明显较空白模型组轻，推测槲皮素治疗NAFLD的重要机制可能是自身作为一种抗氧化剂，具有明显的抗氧化作用，抑制或防止脂质过氧化，减轻肝脏脂肪沉积.至于槲皮素治疗NAFLD的其他机制还有待进一步研究.
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参考文献：
〔1〕李秀丽,唐晓光,高丽枫，等.荜茇-13味治疗大鼠非酒精性脂肪肝病的实验研究[J]．赤峰学院学报（自然科学版），2011，27（1）：35-37．
〔2〕李秀丽，邹继红，刘青妍，等．槲皮素改善肝细胞脂质堆积作用的实验研究[J]．时珍国医国药，2011，22(10):2384～2386．
〔3〕XIULI LI, RONG WANG, NA ZHOU,et,al. Quercetin improves insulin resistance and hepatic lipid accumulation in vitro in a NAFLD cell model. BIOMEDICAL REPORTS 1: 71-76, 2013．
〔4〕董婷，卢胜家，刘璇，等.氧化应激在非酒精性脂肪性肝炎发病机制中的作用[J].肝脏,2012,17(8):602-604．
〔5〕杨丽丽,柳涛,王森,等.氧化应激与非酒精性脂肪性肝病研究进展[J].世界华人消化杂志，2009，17(9):896-900．
〔6〕池肇春,周长宏,史光军,等.非酒精性脂肪性肝病[M].北京：军事医学科学出版社，2009．80．
〔7〕Michikawa Y，Mazzucchelli F，Bresolin N,et al.Aging-dependent large accumulation of point mutations in the human mtDNA control region for replication[J]．science，1999，286：774～779．