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采用稀释法评价狼疮抗凝物对凝血因子活性检测的干扰

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  • 更新时间2022-01-04
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  摘    要:目的 探讨稀释法在评价狼疮抗凝物(LAC)对凝血因子活性检测的干扰中的应用。方法 选取该院健康体检者30例作为作为对照组,将这30例受试者的混合血浆标本分别按1∶1、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25 6种不同稀释比例配制成不同浓度的血浆,检测标本中的凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ活性,将其与所对应稀释度的理论值作线性相关分析。选取于该院住院治疗的LAC阳性且凝血酶原时间(PT)、活化的部分凝血活酶时间(APTT)均延长的抗磷脂综合征患者6例作为LAC阳性组。将6例LAC阳性组患者的血浆标本按同样的方法进行梯度稀释并对上述8种凝血因子的活性进行检测。结果 对照组8种凝血因子活性检测值与理论值均呈直线相关(R2≥0.90,P<0.05)。随着稀释倍数的增加,内源性凝血因子活性随之升高,能恢复到大致正常水平,且升高到一定水平时不再随着稀释倍数的增加而继续升高。结论 病理性抗凝物质如LAC可对内源性凝血因子活性检测造成干扰,稀释法可通过降低干扰物质的滴度来获得更加准确的凝血因子检测值。

  

  关键词:狼疮抗凝物 凝血因子活性 稀释曲线法

  

  Using dilution method to evaluate the interference of lupus anticoagulant in the detection of coagulation factor activity

  

  YAN Nan HAN Feng DIAO Yanjun CHEN Qiying LIU Jiayun

  

  Department of Clinical Laboratory,Xijing Hospital Affiliated to Air Force Military Medical University;

  

  Abstract:Objective To investigate the application value of dilution method in evaluating the interference of lupus anticoagulant(LAC) in the detection of coagulation factor activity.Methods A total of 30 healthy people in the hospital were enrolled as the control group, and the mixed plasma sample of the 30 healthy people were prepared into different concentrations of plasma according to 6 different dilution ratios 1∶1,1∶21,1∶22,1∶23,1∶24,1∶25,detected the coagulation factors FⅧ,FⅨ,FⅪ,FⅫ,FⅡ,FⅤ,FⅦ,FⅩ activity in the plasma sample, and make a linear correlation analysis with the theoretical value of the corresponding dilution.Six patients with antiphospholipid syndrome who were hospitalized in the hospital with LAC positive and prolonged partial thromboplastin time(PT) and activated partial thromboplastin time(APTT) were enrolled as the LAC positive group. The plasma samples of the 6 patients in the LAC positive group were serially diluted in the same way and the activity of the above 8 coagulation factors were detected.Results In the control group, the detected activity values of the 8 coagulation factors were linearly correlated with the theoretical values(R2≥0.90,P<0.05).As the dilution ratios increased, the endogenous coagulation factor activity increased and could return to roughly normal levels, and when it reached a certain level, it no longer continued to increase as the dilution factor increased. Conclusion Pathological anticoagulants such as LAC can interfere with the detection of endogenous coagulation factor activity.The dilution method can be used to obtain more accurate coagulation factor detection values by reducing the titer of interfering substances.

  

  Keyword:lupus anticoagulants; coagulation factor activity; dilution method;

  

  狼疮抗凝物(LAC)是一种磷脂依赖的病理性循环抗凝物质,是抗磷脂抗体(APL)的一种[1],为IgG或IgM的异质性免疫球蛋白。主要通过结合β2糖蛋白Ⅰ、人凝血酶原及其他磷脂复合物来干扰磷脂依赖的凝血过程,使体外检测的凝血时间延长[2]。持续LAC阳性的患者被认为有较高的血栓形成和复发风险,与不明原因习惯性流产、死胎、血栓性疾病及某些自身免疫性疾病密切相关[3]。因LAC的异质性,检测试剂种类、磷脂构成和浓度、检测原理(有磁珠法与光学法、散射光与透射光)的不同,以及检测反应终点判断方式的不同等均会影响到检测结果[4]。有部分LAC阳性的患者有凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)的延长,会使凝血因子活性的检测出现假性降低的结果。稀释法是指将原血浆标本按不同稀释比例进行稀释。由于凝血因子的促凝过程是一系列酶促反应,其反应速度与强度在一定范围内与凝血因子的活性呈线性相关[5],故稀释后各浓度血浆的凝血因子活性通过乘以稀释倍数,可校正为与检测结果相同或相近的结果[6]。若存在病理性的抗凝物质,如LAC,稀释法可以通过降低干扰物质的滴度,使检测结果能更准确地反映体内凝血因子的真实水平。

  

  1 资料与方法

  

  1.1 一般资料

  

  在2020年10月至2021年4月于本院住院治疗的抗磷脂综合征(APS)患者中选取LAC阳性[LAC检测采用改良的稀释蝰蛇毒时间试验(dRVVT)进行筛选和确诊试验,计算LA比值(LA比值=筛选试验比值/确诊试验比值),LA比值>1.2为阳性]且PT、APTT均延长的6例患者作为LAC阳性组,男1例、女5例,年龄14~49岁、平均26.33岁。另外,选取同期于本院体检的健康者30例作为对照组,男、女各15例,排除有先天性凝血功能障碍、凝血因子缺乏、肝脏疾病、严重感染、血栓栓塞性疾病者,年龄23~56岁,平均36.00岁。

  

  1.2 仪器与试剂

  

  使用的检测仪器为Sysmex公司生产的Sysmex CS5100型全自动凝血分析仪。PT、APTT、凝血因子活性、LAC检测试剂或试剂盒及质控品均为德国西门子公司产品。

  

  1.3 方法

  

  采集受试者清晨空腹静脉血于枸橼酸钠抗凝管中,以1 500×g离心15 min后分离血浆。采用全自动凝血分析仪及相应的配套试剂进行检测。对照组:将30例受试者的混合血浆分别按1∶1、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25 6种不同稀释倍数配制成不同浓度的血浆,稀释液选用德国西门子公司生产的原装OVB缓冲液。分别检测凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ活性,将其与所对应稀释度的理论值作线性相关分析。LAC阳性组:用同样的方法采集6例LAC阳性组患者标本,将6例患者的标本分别按同样的方法进行梯度稀释并对上述8种凝血因子的活性进行检测。

  

  1.4 统计学处理

  

  采用spss26.0统计学软件进行数据处理和统计学分析,检验水准α=0.05;应用GraphPad Prism 8软件绘图。

  

  2 结 果

  

  2.1 对照组凝血因子活性检测值与理论值的相关性分析

  

  对照组8种凝血因子活性检测值与理论值均呈直线相关(R2≥0.90,P<0.05),见图1。凝血因子活性在不存在任何干扰物质的情况下随稀释度的增加而逐渐降低。

  

  图1 对照组凝血因子活性检测值与理论值的线性相关分析

  

  2.2 LAC阳性组凝血因子活性检测

  

  随着稀释倍数的增加,内源性凝血因子(FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ)活性随之升高,能恢复到大致正常水平,且升高到一定水平时不再随着稀释倍数的增加而继续升高。此处列举LAC比值最高患者的检测结果,见表2。

  

  表2 LAC比值最高患者的8种凝血因子不同稀释 倍数的检测结果(%)

  

  3 讨 论

  

  APTT检测是一项针对内源性凝血途径的筛查试验,参与内源性凝血的因子主要有FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ。APTT的检测方法为凝固法。当APTT延长时通常提示内源性凝血功能障碍[7],与血液不凝和出血有关。LAC阳性患者体内的LAC可直接与凝血酶原上的抗原决定簇结合,抗原抗体复合物与阴离子磷脂相结合,抑制凝血酶原、FⅧ、FⅨ、FⅩ等与磷脂微粒的结合,也可导致APTT延长[8]。内源性凝血因子的检测方法同样为凝固法[9],其原理是通过把不同稀释度的标准血浆检测得到的APTT值绘制成标准曲线来读取凝血因子活性水平,可以分别测得内源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的活性。dRVVT的原理是在待测血浆中加入激活剂蝰蛇毒和钙离子,鲁赛尔氏蝰蛇毒可直接活化凝血因子X使血液凝固[3]。其包括筛选试验和确证试验。如果血浆中存在LAC能使筛选试验的凝固时间延长。确诊试验的试剂和筛选试验试剂一样,但其含高浓度磷脂,外源性磷脂与LA抗体结合,很大程度上纠正了凝固时间。计算其比值(LA比值=筛选试验比值/确诊试验比值),若LA比值>1.2,则判断患者为LAC阳性[10]。该试验证明LAC存在特异且简便的检测手段。国际血栓与止血学会(ISTH)与临床实验室和标准化协会(CLSI)分别在2009年与2014年更新了关于LAC检测相关指南文件[11-12],指南均推荐将dRVVT和APTT两种试验作为LAC的一线筛查试验。

  

  当LAC阳性患者表现出APTT假性延长时,需要通过APTT来反映的内源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性检测也同样会受到干扰。这无疑将大大增加临床的诊疗难度。临床应分析患者是否存在可导致LAC阳性的感染或药物的使用,进一步检测并排除自身免疫性疾病。LAC阳性的自身免疫性疾病以系统性红斑狼疮(SLE)[13]和APS多见,其中LAC阳性是APS的诊断标准之一[14]。当实验室检测间隔12周以上,连续2次检测LAC为阳性时,加上一项血栓形成或复发性流产的临床表现即可诊断APS。LAC阳性患者被认为有较高的血栓风险[15],但极少有LAC阳性患者发生出血[16]。

  

  本研究首先将健康人混合血浆标本各稀释度的凝血因子活性检测结果与其对应稀释度的理论活性值进行线性相关分析,8种凝血因子活性检测值与理论值均呈直线相关(R2≥0.90,P<0.05),而且凝血因子活性在不存在任何干扰物质的情况下随稀释度的增加而逐渐降低,即只表现为单纯的稀释效应。另外,本研究收集了6例LAC阳性且PT、APTT均延长的患者标本,用稀释法进行了同样的凝血因子活性检测。结果显示随着稀释度的增加,凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性并没有表现出稀释效应,而是随稀释比例增加而逐渐升高最终恢复至大概正常水平,即明确提示存在干扰。因其标本在稀释的过程中LAC的滴度也随之降低,最终可以得到相对准确的结果。对于内源性凝血因子活性降低且LAC升高的患者,应综合分析实验室的检测结果,并需要进一步采用稀释法对凝血因子活性进行检测。而FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ的活性变化较小是由于这4个凝血因子主要反映外源性凝血途径的凝血状况,而LAC主要作用于凝血酶原复合物(因子Ⅹa、Ⅴa、Ca2+及磷脂)以及Tenase复合物(因子Ⅸa、Ⅷa、Ca2+及磷脂),并能在体外延长磷脂依赖的凝血试验的时间[17]。所以内源性凝血途径的筛查试验APTT对LAC较敏感,通过APTT检测得到的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性也更易受到干扰。在明确APTT延长的原因是LAC且不存在其他出血风险因素时,不应将APTT延长与内源性凝血因子活性降低视为手术禁忌。

  

  临床实验室有必要开展凝血因子活性、LAC等特殊项目的检测,以协助复杂出血性疾病与血栓性疾病的诊断。最后,实验室应与临床科室密切沟通,使临床科室充分了解影响实验室检测结果的干扰因素以及各类疾病的实验室检测路径,避免错误理解和使用检验结果,从而共同为患者提供更加快速、准确的诊断与治疗。

  

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