摘要：目的：建立HPLC法测定腰痛丸中升麻素苷和橙皮苷的含量。方法：采用WatersCAPCELLPAKC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为0.2mol/L醋酸铵溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱程序为0min(80%A),30min(35%A)、31min(80%A)、35min(80%A)，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为284nm。结果：在30min内腰痛丸中升麻素苷和橙皮苷被完全分离；峰面积与其浓度呈良好的线性关系。结论：该定量测定方法简便快速、结果精确可靠并且重现性好，可作为腰痛丸质量控制方法的一部分。
关键词：腰痛丸 升麻素苷 橙皮苷 HPLC法
腰痛丸为棕褐色至棕黑色的水蜜丸，气微香，味微苦、甘、辛。腰痛丸是由防风、防己和陈皮等十五味中药配伍构成[1]。该药可以祛风散寒、温经通络止痛，风寒腰痛及关节炎等症可以用该药治疗。腰痛丸中有效成分的定量研究目前尚未见报道，本实验采用HPLC法对腰痛丸中主药防风所含升麻素苷和陈皮所含橙皮苷的含量进行研究，对于腰痛丸的质量控制标准具有一定的意义。防风通圣丸药方组成共17味，具有清泻体热、疏邪外散的作用，通常应用于表里俱实、风热壅盛证。本品的质量标准在《中国药典》2010年版一部中提出，但原标准中仅通过薄层鉴别、显微鉴别等定性鉴别，制剂通常不具有含量测定项，本研究利用HPLC法测量5-0-甲基维斯阿米醇苷、防风中升麻素苷的含量，使该药物能够逐步完善，提高药品的质量标准。
仪器与试药
仪器：Waters2695高效液相色谱仪、Waters2996二极管阵列紫外检测器(PAD),Empower色谱工作站；XS205DU电子天平。
对照品：升麻素苷(批号111522-201209)、橙皮苷(批号110721-201316)均购自中国食品药品检定研究院。
供试品：腰痛丸(我市某医院制剂科提供，批号170115、180601、180907)。
试剂：甲醇、醋酸铵溶液；纯化水。
方法与结果
流动相与色谱条件：(1)流动相选择：在流动相的选择中，考察了不同比例甲醇-0.2M醋酸铵溶液、甲醇-水作为流动相进行梯度洗脱，最后发现以甲醇-0.2M醋酸铵溶液进行梯度洗脱时，所测得的升麻素苷和橙皮苷各组分的峰形良好，可以完全分离，分离度>3[2];(2)检测波长的选择：本实验采用了二极管阵列检测器，参考了药典中升麻素苷和橙皮苷的检测波长，确定检测波长为284nm;(3)柱温和体积流量的选择：本实验考察了在不同柱温(25℃、30℃、35℃)、不同流速(0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min)的影响，经试验，结合峰形和分离度，确定最佳的柱温为30℃，流速为1.0mL/min[3];(4)色谱条件：色谱柱：WatersCAPCELLPAKC18色谱柱(4.6mm×250mm,5-Micron)；流动相：0.2mol/L醋酸铵溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱程序为0min(80%A)、30min(35%A)、31min(80%A)、35min(80%A)；流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为284nm；进样量20μL。
混合对照品溶液的制备：称取升麻素苷对照品约15mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加入甲醇振摇使其溶解，并用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液(1)；称取橙皮苷对照品约15mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加入甲醇振摇使其溶解，并用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液(2)。分别从对照品溶液(1)、(2)中各精密吸取1mL，置于同一20mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液(1)。再分别从对照品溶液(1)、(2)中各精密吸取2mL，置于同一10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液⑵。
供试品溶液的制备：从3个批次中各称取腰痛丸约20g，研细，取约5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇100mL，称重，水浴回流2h，放冷，再称定重量，加甲醇到原先的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液[4]。
方法学考察：(1)专属性实验：分别精密吸取上述供试品溶液和混合对照品溶液各20μL，按色谱条件进行测定[5]。结果表明，对照品：峰1为升麻素苷，峰2为橙皮苷(284nm)。供试品：峰1为升麻素苷，峰2为橙皮苷(284nm)。升麻素苷和橙皮苷分离度良好，不受其他组分的干扰。(2)线性关系考察：取混合对照品溶液⑴按色谱条件分别进样5μL、10μL、20μL，取混合对照品溶液(2)按色谱条件分别进样10μL、20μL，记录色谱图，采用获得图谱各对照品相应的峰面积Y，并按照各对照品单个成分的进样量X制作标准曲线。获得的回归方程分别为：升麻素苷Y=2000000X+22958,R2=0.99994；橙皮苷Y=1000000X+104800.25,R2=0.99984。表明在一定的线性范围内，升麻素苷和橙皮苷的进样量与峰面积呈良好的线性关系[6]。(3)精密度试验：精密吸取混合对照品溶液(1)10μL，连续进样6次，按色谱条件进行测定，记录色谱图。升麻素苷和橙皮苷峰面积的RSD分别为0.44%、0.32%。说明该仪器精密度良好[7]。(4)稳定性试验：取同一批号的腰痛丸制备供试品溶液，将其分别在室温下放置，在0、4、8、16、24h，按色谱条件进样测定，每次进样量为20μL，记录相应峰面积值，升麻素苷和橙皮苷的峰面积的RSD分别为0.73%和0.46%，表明24h内供试品溶液具有良好的稳定性[8]。(5)重复性考察：称取适量的同一批号腰痛丸作为供试品，分别制备5份供试品溶液，按色谱条件进行测定。结果表明，升麻素苷的RSD为0.74%，橙皮苷的RSD为0.13%。说明本方法重复性良好。(6)加样回收率试验：精密称取已知含量的腰痛丸5g，共5份，置于具塞瓶中，精密加入升麻素苷对照品溶液(1.4990mg/mL)1.0mL，橙皮苷对照品溶液(0.7545mg/mL)1.0mL，加甲醇100mL，称重，水浴回流2h，放冷，再称重，加甲醇到原先的重量，摇匀，滤过，即得加样回收试验的供试品溶液。按规定测定并获得回收率，升麻素苷、橙皮苷的回收率分别为98.20%和98.50%，符合实验要求。
供试品的含量测定：取3批样品依法检测并计算含量。结果如下：升麻素苷三批平均含量为0.0542mg/g，橙皮苷三批平均含量为0.1901mg/g。
结论
防风属于方中君药，能够具有疏风解表的功效，现已能够从生药防风中逐渐分离出各种化学成分，共计100种以上，防风主要成分为色原酮类以及挥发油等。其中5-0-甲基维斯阿米醇苷及色原酮类的升麻素苷属于其中的主要活性成分，相关报道研究中提出，通过5-0-甲基维斯阿米醇苷的用量对防风通圣丸的指标成分进行控制，进一步实现质量控制，但以上两种成分属于色原酮类，药理作用相似。如果单纯用5-0-甲基维斯阿米醇苷做指标成分得出的结论比较片面，因此本次对于升麻素苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷的指标总量进行研究，本次根据相关文献对于不同比例的乙腈-水、甲醇-水等多种流动相进行比较，最终对于甲醇-醋酸-水按5:4:61进行确定，此流动相能够改善分离度同时利用甲醇作为溶剂，实施加热回流能够实现成分提取完全。
本文利用HPLC法，建立测定腰痛丸中升麻素苷和橙皮苷含量的检测方法。该定量测定方法简便快速、结果精确可靠并且重现性好，可作为腰痛丸中升麻素苷和橙皮苷质量控制标准的组成部分。
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版).北京:中国医药科技出版社,2010:229.
[2]柏冬,范斌,牛晓红,等.多波长高效液相色谱法同时测定桂枝汤中5种有效成分的含量[J].药物分析杂志,2010,30(1):1-5.
[3]何昱,成金乐,徐吉银,等.HPLC-DAD同时测定丹参中原儿茶醛、丹酚酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA四种成分的含量[J].中国中药杂志,2011,13(4):688-692.
[4]李家实.中药鉴定学.上海:上海科学技术文献出版社,1996:477-499.
[5]王坚,徐菁,李鹏,等.HPLC法同时测定产灵丸中4种有效成分[J].实用药物与临床,2016,19(1):71-74.
[6] Adnan A Kadi,Mostafa S Mohamed,Mohamed G Kassem and Ibrahim A Darwish.A validated stability-indicating HPLC method for determination of varenicline in its bulk and tablets[J].Chemistry Central Journal,2011,5:1-7.
[7] Lei Zhou,Wen Qi,Toshiaki Makino,et al.A rapid method for simultaneous determination of 52 marker compounds in Xiao-Qing-Long-Tang by ultra high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J].Research Article,2014.
[8]姬雪礼,李文烈,张永峰,等.辛防通窍片中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定[J].中国药业,2013,22(11):38-40.