孟凡兵1 范东旭2 刘 丽3 金 松2
1 吉林省长春市解放军461 医院 吉林省长春市 130000
2 黑龙江省佳木斯市佳木斯大学附属第一医院 血管外科 黑龙江省佳木斯市 154007
3 黑龙江省人民医院 血管外科 黑龙江省 哈尔滨市 154000
【摘 要】目的：探讨Notch 信号通路对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的mRNA 水平的影响。方法：本课题从不同梯度浓度γ- 分泌酶抑制剂(DAPT) 干预Notch 信号通路后对DM 大鼠VSMCs 基因影响进行论述。结果：通过实时定量PCR 方法分析得出，加γ- 分泌酶抑制剂（DAPT) 的培养基的 DM 大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs) 溶解温度峰值Tm 进行检测得出：溶解曲线呈单峰，溶解温度在86.0℃ -84.0℃之间，溶解温度变化小，表明为特异性扩增。结论：实验结果显示DAPT 干预Notch 信号通路后，对体外培养的DM 大鼠VSMCs 的mRNA 有抑制趋势，复制率下降，使其溶解温度峰值前移，溶解曲线呈单峰，将会导致进一步细胞凋亡。
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关键词 PCR；糖尿病大鼠；DAPT；血管平滑肌细胞；mRNA
1 材料与方法
本课题前期的糖尿病大鼠模型建立、糖尿病大鼠主动脉血管病变检测、糖尿病大鼠VSMCs 体外培养及鉴定以及不同梯度浓度γ- 分泌酶抑制剂(DAPT) 干预Notch 信号通路后对DM 大鼠VSMCs 活性及毒性、凋亡、细胞周期的影响均已完成，且DM 大鼠VSMCs 已完成冻存。仅从不同梯度浓度γ- 分泌酶抑制剂(DAPT) 干预Notch 信号通路后对DM 大鼠VSMCs 基因影响进行论述。
1.1 实验对象
取已完成的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞，进行细胞复苏与传代。
1.1.1 VSMCsmRNA 的抽提
取冻存已裂解的细胞，在常温下放置到完全溶解。溶解RNA 时，先加入无RNA 酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA 溶液保存于-80℃，作为实时定量PCR 扩增实的模版。
1.1.2 RNA 质量检测，紫外吸收法测定取少量RNA 溶液用TE 稀释（1:100）后，读取260nm 和280nm 两处的吸收值，测定RNA 溶液的浓度和纯度。进行浓度测定， 在进行纯度检测，mRNA 纯度为mRNA 溶液的A260/A280 的比值，比值范围1.9 到2.1.
2 反应条件
如表1。
3 引物设计软件
Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补。
根据文献设计出相应的引物。
目标基因：
上游引物为5 ＇ : TTA TTA GAG GGTGGG GCG GAT CGC TAT 3 ＇下游引物为5 ＇：GAC GAC CCCGAA CCG CGA CCG TAA CAG 3 ＇扩增条目的条带大小为155bp。对照基因：
上游引物5 ＇ : TTA TTA GAG GGTGGG GTG GAT TGT TAT3 ＇下游引物5 ＇： CAA GAC CCC GAACCG CGA CCG ATA CCA3 ＇扩增条目的条带大小为156bp。
4 结果
通过实时定量PCR 方法分析得出，加γ- 分泌酶抑制剂（DAPT) 的培养基的DM 大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs) 溶解温度峰值Tm 进行检测看见：溶解温度在86.0℃——84.0℃之间，溶解温度单一，溶解曲线呈单峰，标明为特异性扩增。而对照组（正常培养基）未见特异性峰值。从PCR 溶解曲线我们看见DAPT 干预Notch信号通路后对体外培养的DM 大鼠VSMCs的mRNA 有抑制趋势，使其溶解温度峰值前移，溶解曲线呈单峰，复制率下降，将会导致细胞凋亡。
5 结论
本课题通过实时定量PCR 技术分析探讨Notch 信号通路在糖尿病大鼠血管再生及成熟中的作用机制，分析探讨Notch 信号通路对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的mRNA 水平有何影响，为进一步研究糖尿病患者血管再生提供依据，有可能成为获得更多有功能的血管以促进血管新生，为临床治疗糖尿病足溃疡、缺血性疾病、改善预后提供新思路和新途径，并为以后系统科学地研究血管再生提供方向，为缺血性疾病的治疗提供靶向药物，希望在不久之后会应用到临床治疗中，造福广大糖尿病足溃疡、缺血性疾病患者，实现从实验室到临床的完整对接，进一步提升糖尿病足溃疡、缺血性疾病治疗的基础研究水平。
（通讯作者：金松）
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