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高效液相色谱法测定炒土鳖虫中尿嘧啶和尿苷含量

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  • 更新时间2021-02-25
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摘  要:目的:建立炒土鳖虫中有效成分尿嘧啶和尿苷的高效液相色谱测定方法。方法:采用Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-(955)作为流动相,流速为1.0 mL/min,温度40℃,紫外检测器,检测波长为205 nm。结果:高效液相色谱法(HPLC)检测炒土鳖虫尿嘧啶和尿苷在0.5010.0μg/mL(r=0.999 9)范围内呈良好的线性关系,尿嘧啶平均回收率为98.56%(RSD=1.0%,n=6),尿苷平均回收率为98.06%(RSD=0.8%,n=6)。结论:HPLC测定炒土鳖虫中的有效成分尿嘧啶和尿苷,其操作方法简单快速,结果准确可靠,是一种有效测定含量的方法。

关键词:炒土鳖虫 高效液相色谱法 尿嘧啶 尿苷 平均回收率


土鳖虫学名虫,又称地鳖、过街、簸箕虫、地乌龟、土元等[1],为常用中药材。土鳖虫始载于《神农本草经》,历代医学著作如《本草纲目》和《本草经疏》中也有收载,具有破瘀血,续筋骨的功效,用于跌打损伤,筋伤骨折,血瘀经闭,产后瘀阻腹痛,癥瘕痞块。土鳖虫含有蛋白质、氨基酸、生物碱、脂肪酸、无机元素、高级醇及其衍生物等,具有抗凝血、抗缺氧、调节血脂等药理作用。历版《中国药典》均有收载,现收载于《中国药典》2015版一部。土鳖虫味咸,性寒;有小毒;归肝经。土鳖虫在“脑塞通丸(大蜜丸、水蜜丸)”组方中均以炒土鳖虫粉碎成细粉入药,企业生产中用量较大。炒土鳖虫为土鳖虫的清炒炮制加工品,取药材,净选,置于热锅(180±10)℃中,翻炒(25±10)min,翻炒频率22/min,炒至颜色加深,腥气逸出时取出,晾凉。该炮制方法拟收载于吉林省中药材标准中。土鳖虫经炒制后,消除其不良气味,质变酥脆,便于粉碎和服用。现代研究表明土鳖虫中的尿嘧啶参与多种核苷的代谢,可促进伤口愈合并有生肌作用,尿苷是构成动物细胞核酸的有关成分,能提高机体抗体水平[2],具有以下作用:(1)抗肿瘤活性及抑制血管生成;(2)抗凝血和抗血栓;(3)调节血脂;(4)抗氧化、增强免疫、抗菌。土鳖虫的水提取液以及从中得到的尿嘧啶、尿囊素、鲨肝醇和棕榈酸都有明显的镇痛作用。经过炮制后的土鳖虫药理作用发生改变,如炒土鳖虫中尿嘧啶含量升高,因此炒土鳖虫能增强镇静、镇痛作用。本次研究采用高效液相色谱法(HPLC)测定炒土鳖虫中尿嘧啶和尿苷的含量,为开发利用炒土鳖虫资源提供了科学依据,能进一步促进生产、流通和医药使用单位炒土鳖虫饮片质量的提高。

材料与方法

实验仪器:高效液相色谱仪(岛津LC2030),四元低压梯度泵、在线真空脱气机,自动进样器、紫外检测器;色谱柱:Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5μm);超声波清洗器(JCX-400Z型,山东省济宁市超声电子仪器厂),功率300 W,频率80 k Hz;紫外检测器(UV);Agilent 8453紫外可见分光光度计;METTLER TOLEDO电子天平。

实验试剂与药物:尿嘧啶对照品20 mg,供HPLC含量99.6%,中国食品药品检定研究院提供,批号:100469-201302;尿苷对照品20 mg,供HPLC含量99.2%,中国食品药品检定研究院提供,批号:110887-201803;乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)均为霍尼韦尔贸易(上海)有限公司产品;纯净水(吉林娃哈哈食品有限公司);炒土鳖虫。

实验方法:(1)色谱条件与系统适应性实验:色谱柱以氨基键合硅胶为填充剂,以乙腈-(955)为流动相,检测波长为205 nm。理论板数按尿苷峰计算应不低于3 000(2)溶液制备:(1)对照品溶液[3-4]:分别精密称取尿嘧啶对照品和尿苷对照品适量,用70%甲醇稀释制成每1 m L中各含5μL的对照品混合溶液。(2)供试品溶液:将炒土鳖虫粉碎末过4号筛,精密称取0.30 g,置25 m L量瓶中,加入70%甲醇,超声处理(功率300 W,频率80 k Hz)25 min,放冷,再用70%甲醇稀释至刻度,即得。分别精密吸取对照品混合溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,记录色谱图[5-8]

结果

线性关系考察:取尿嘧啶对照品和尿苷对照品适量,加70%甲醇制成分别含尿嘧啶和尿苷0.51.02.05.07.510.0μg/m L的对照品溶液。将尿嘧啶和尿苷对照品溶液分别按顺序依次进样10μL,记录色谱图。以峰面积(Y)为纵坐标,进样浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线。尿嘧啶对照品溶液回归方程为Y=6054 5X+86.56,r=0.999 9;尿苷对照品溶液回归方程为Y=5753 5X+58.54,r=0.999 9。尿嘧啶和尿苷均在0.510.0μg/m L与峰面积呈良好的线性关系。

精密度实验:取炒土鳖虫粉末适量,按“供试品溶液项下的制备方法”将炒土鳖虫粉碎末过4号筛,精密称取约0.30 g,制备供试品溶液,按“实验方法中的色谱条件”,连续进样6次,进样10μL/次,记录供试品溶液中尿嘧啶和尿苷的峰面积,计算峰面积的相对标准偏差(RSD=0.6%),结果表明该方法精密度良好。

重现性实验:取炒土鳖虫粉末适量,按“供试品溶液”项下的制备方法及色谱条件制备供试品,平行制备供试品溶液6份,进样量为10μL,分别计算相对标准偏差,尿嘧啶RSD=0.8%,尿苷RSD=0.9%,结果表明该方法重现性良好。

稳定性实验:取炒土鳖虫粉末适量,按“供试品溶液”项下的制备方法及色谱条件制备供试品,进样量为10μL,在样品放置0246810121824 h时进样,记录供试品溶液中尿嘧啶和尿苷的峰面积,计算峰面积的相对标准偏差(RSD=0.5%),结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

回收率实验:取河南产地已知含量的炒土鳖虫粉末(含尿嘧啶400.4μg/g、尿苷420.0μg/g)0.15 g,按“供试品溶液”项下的制备方法及色谱条件制备供试品,平行制备6份,分别精密加入尿嘧啶对照品溶液(5.0μg/m L)和尿苷对照品溶液(5.0μg/m L)6612121818 m L,再加70%甲醇稀释至25 m L。分别取上述溶液各10μL注入液相色谱仪,计算低、中、高3个浓度的回收率。结果尿嘧啶平均回收率为98.56%,RSD1.0%;尿苷平均回收率为98.06%,RSD0.8%

不同提取溶剂的考察:确定溶解供试品所用的溶剂,依据参考文献[8]方法选择水、甲醇、乙醇等不同溶剂作为稀释剂,实验结果表明采用甲醇作为稀释剂,提取效果最好,有效成分的含量较高。改变溶解供试品所用的溶剂,调整甲醇的比例分别为70%50%30%,实验结果表明甲醇比例为70%时,测得供试品含量最高。所以最终采用70%甲醇作为提取有效成分的溶剂。

检测波长的选择:取尿嘧啶对照品储备液体,进行适当稀释后,在紫外可见分光光度计中进行光谱扫描,选择最佳检测波长,结果显示尿嘧啶在205 nm波长处有较强的吸收。另取尿苷对照品储备液体,进行适当稀释后,在紫外可见分光光度计中进行光谱扫描,选择最佳检测波长,结果显示尿苷在紫外区没有明显的吸收,这与文献所报道的结果相一致[7]。所以最终采用205 nm作为紫外光谱的检测波长。

流动相的选择:本次研究中尝试采用乙腈-水以及甲醇-水的不同比例作为流动相对尿嘧啶和尿苷含量进行测定,结果显示采用乙腈-水作为流动相,尿嘧啶和尿苷与色谱中其他组分分离效果更好。为了将流动相的比例调整到最优化状态,将乙腈-水比例分别设置为9010937955973,实验结果表明在乙腈-(955)时流动相洗脱效果最好,尿嘧啶和尿苷与相邻峰的分离度均能够达到2.0以上,且理论板数均能超过3 500。因此选择乙腈-(955)作为流动相。

尿嘧啶和尿苷线性关系的考察:取尿嘧啶对照品加溶剂分别制成含尿嘧啶0.2、0.51.02.05.07.510.020.050.0μg/m L的对照品溶液。按顺序依次进样10μL,记录色谱图,结果尿嘧啶在0.510.0μg/m L与峰面积呈良好线性关系。另取尿苷对照品加溶剂分别制成含尿苷0.20.51.02.05.07.510.020.050.0μg/m L的对照品溶液。按顺序依次进样10μL,记录色谱图,结果尿苷在0.510.0μg/m L与峰面积呈良好线性关系。实验表明尿嘧啶和尿苷均在0.510.0μg/m L与峰面积呈良好线性关系。

不同色谱柱的考察:选取Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)Waters NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)3个不同厂家的色谱柱,柱长均为250 mm。本实验需采用氨基柱进行分析测定。结果表明尿嘧啶和尿苷色谱峰的对称性、分离度和理论塔板数无显著差异,均符合要求。

不同流速的考察:将“色谱条件”项下的流速分别设定为0.81.01.2 m L/min,进行考察实验。结果表明,各流速条件下,尿嘧啶和尿苷色谱峰的分离度均较好。

不同柱温的考察:分别在30℃、40℃和室温时进样分析。结果表明,在40℃条件下,尿嘧啶和尿苷色谱峰的对称性、分离度和理论塔板数最高。

不同产地炒土鳖虫中尿嘧啶和尿苷含量测定结果:分别选取安徽省亳州市、河北省安国市、山西省万荣县三个产地的样品进行测定,结果尿嘧啶的含量分别为0.43 mg/g、0.40 mg/g0.48 mg/g,尿苷的含量分别为0.28 mg/g0.32 mg/g0.31 mg/g

讨论

采用HPLC对炒土鳖虫中的有效成分尿嘧啶和尿苷进行测定,样品的处理过程较为简单,重现性良好,方法操作简单,结果准确,回收率高,可以作为评价中药炒土鳖虫中有效成分的质量方法。


参考文献

[1]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海科技出版社,1997:2684.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015:227.

[3]蔡少青.常用中药材品种整理和质量研究[M].北京:北京医科大学出版社,2003:222-264.

[4]杨金玲,张立国.土鳖虫炮制方法及质量问题分析[J].传统医药,2003,1(8):53.

[5]王丽娜,王颖,朱明珠.土鳖虫的活性成分及药理研究进展[J].化工时刊,2017,31(6):34-36.

[6]景晶,曹红.HPLC法测定土鳖虫中尿嘧啶和尿囊素的含量[J].药学实践杂志,2010,28(2):134-136.

[7]李洪,熊敏.高效液相色谱法测定土鳖虫中尿嘧啶、次黄嘌呤和尿苷含量[J].河南中医,2014,34(8):1634-1635.

[8]万丹,蔡萍,张水寒.土鳖虫超微粉体中尿嘧啶、次黄嘌呤的含量测定[J].湖南中医药大学学报,2011,31(9):36-40.