摘 要：目的：建立炒土鳖虫中有效成分尿嘧啶和尿苷的高效液相色谱测定方法。方法：采用Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)，以乙腈-水(95∶5)作为流动相，流速为1.0 mL/min，温度40℃，紫外检测器，检测波长为205 nm。结果：高效液相色谱法(HPLC)检测炒土鳖虫尿嘧啶和尿苷在0.50～10.0μg/mL(r=0.999 9)范围内呈良好的线性关系，尿嘧啶平均回收率为98.56%(RSD=1.0%,n=6)，尿苷平均回收率为98.06%(RSD=0.8%,n=6)。结论：HPLC测定炒土鳖虫中的有效成分尿嘧啶和尿苷，其操作方法简单快速，结果准确可靠，是一种有效测定含量的方法。
关键词：炒土鳖虫 高效液相色谱法 尿嘧啶 尿苷 平均回收率
土鳖虫学名虫，又称地鳖、过街、簸箕虫、地乌龟、土元等[1]，为常用中药材。土鳖虫始载于《神农本草经》，历代医学著作如《本草纲目》和《本草经疏》中也有收载，具有破瘀血，续筋骨的功效，用于跌打损伤，筋伤骨折，血瘀经闭，产后瘀阻腹痛，癥瘕痞块。土鳖虫含有蛋白质、氨基酸、生物碱、脂肪酸、无机元素、高级醇及其衍生物等，具有抗凝血、抗缺氧、调节血脂等药理作用。历版《中国药典》均有收载，现收载于《中国药典》2015版一部。土鳖虫味咸，性寒；有小毒；归肝经。土鳖虫在“脑塞通丸(大蜜丸、水蜜丸)”组方中均以炒土鳖虫粉碎成细粉入药，企业生产中用量较大。炒土鳖虫为土鳖虫的清炒炮制加工品，取药材，净选，置于热锅(180±10)℃中，翻炒(25±10)min，翻炒频率22转/min，炒至颜色加深，腥气逸出时取出，晾凉。该炮制方法拟收载于吉林省中药材标准中。土鳖虫经炒制后，消除其不良气味，质变酥脆，便于粉碎和服用。现代研究表明土鳖虫中的尿嘧啶参与多种核苷的代谢，可促进伤口愈合并有生肌作用，尿苷是构成动物细胞核酸的有关成分，能提高机体抗体水平[2]，具有以下作用：(1)抗肿瘤活性及抑制血管生成；(2)抗凝血和抗血栓；(3)调节血脂；(4)抗氧化、增强免疫、抗菌。土鳖虫的水提取液以及从中得到的尿嘧啶、尿囊素、鲨肝醇和棕榈酸都有明显的镇痛作用。经过炮制后的土鳖虫药理作用发生改变，如炒土鳖虫中尿嘧啶含量升高，因此炒土鳖虫能增强镇静、镇痛作用。本次研究采用高效液相色谱法(HPLC)测定炒土鳖虫中尿嘧啶和尿苷的含量，为开发利用炒土鳖虫资源提供了科学依据，能进一步促进生产、流通和医药使用单位炒土鳖虫饮片质量的提高。
材料与方法
实验仪器：高效液相色谱仪(岛津LC2030)，四元低压梯度泵、在线真空脱气机，自动进样器、紫外检测器；色谱柱：Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)；超声波清洗器(JCX-400Z型，山东省济宁市超声电子仪器厂)，功率300 W，频率80 k Hz；紫外检测器(UV);Agilent 8453紫外可见分光光度计；METTLER TOLEDO电子天平。
实验试剂与药物：尿嘧啶对照品20 mg，供HPLC含量99.6%，中国食品药品检定研究院提供，批号：100469-201302；尿苷对照品20 mg，供HPLC含量99.2%，中国食品药品检定研究院提供，批号：110887-201803；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)均为霍尼韦尔贸易(上海)有限公司产品；纯净水(吉林娃哈哈食品有限公司)；炒土鳖虫。
实验方法：(1)色谱条件与系统适应性实验：色谱柱以氨基键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(95∶5)为流动相，检测波长为205 nm。理论板数按尿苷峰计算应不低于3 000。(2)溶液制备：(1)对照品溶液[3-4]：分别精密称取尿嘧啶对照品和尿苷对照品适量，用70%甲醇稀释制成每1 m L中各含5μL的对照品混合溶液。(2)供试品溶液：将炒土鳖虫粉碎末过4号筛，精密称取0.30 g，置25 m L量瓶中，加入70%甲醇，超声处理(功率300 W，频率80 k Hz)25 min，放冷，再用70%甲醇稀释至刻度，即得。分别精密吸取对照品混合溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图[5-8]。
结果
线性关系考察：取尿嘧啶对照品和尿苷对照品适量，加70%甲醇制成分别含尿嘧啶和尿苷0.5、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0μg/m L的对照品溶液。将尿嘧啶和尿苷对照品溶液分别按顺序依次进样10μL，记录色谱图。以峰面积(Y)为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。尿嘧啶对照品溶液回归方程为Y=6054 5X+86.56,r=0.999 9；尿苷对照品溶液回归方程为Y=5753 5X+58.54,r=0.999 9。尿嘧啶和尿苷均在0.5～10.0μg/m L与峰面积呈良好的线性关系。
精密度实验：取炒土鳖虫粉末适量，按“供试品溶液项下的制备方法”将炒土鳖虫粉碎末过4号筛，精密称取约0.30 g，制备供试品溶液，按“实验方法中的色谱条件”，连续进样6次，进样10μL/次，记录供试品溶液中尿嘧啶和尿苷的峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(RSD=0.6%)，结果表明该方法精密度良好。
重现性实验：取炒土鳖虫粉末适量，按“供试品溶液”项下的制备方法及色谱条件制备供试品，平行制备供试品溶液6份，进样量为10μL，分别计算相对标准偏差，尿嘧啶RSD=0.8%，尿苷RSD=0.9%，结果表明该方法重现性良好。
稳定性实验：取炒土鳖虫粉末适量，按“供试品溶液”项下的制备方法及色谱条件制备供试品，进样量为10μL，在样品放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h时进样，记录供试品溶液中尿嘧啶和尿苷的峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(RSD=0.5%)，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
回收率实验：取河南产地已知含量的炒土鳖虫粉末(含尿嘧啶400.4μg/g、尿苷420.0μg/g)0.15 g，按“供试品溶液”项下的制备方法及色谱条件制备供试品，平行制备6份，分别精密加入尿嘧啶对照品溶液(5.0μg/m L)和尿苷对照品溶液(5.0μg/m L)各6、6、12、12、18、18 m L，再加70%甲醇稀释至25 m L。分别取上述溶液各10μL注入液相色谱仪，计算低、中、高3个浓度的回收率。结果尿嘧啶平均回收率为98.56%,RSD为1.0%；尿苷平均回收率为98.06%,RSD为0.8%。
不同提取溶剂的考察：确定溶解供试品所用的溶剂，依据参考文献[8]方法选择水、甲醇、乙醇等不同溶剂作为稀释剂，实验结果表明采用甲醇作为稀释剂，提取效果最好，有效成分的含量较高。改变溶解供试品所用的溶剂，调整甲醇的比例分别为70%、50%、30%，实验结果表明甲醇比例为70%时，测得供试品含量最高。所以最终采用70%甲醇作为提取有效成分的溶剂。
检测波长的选择：取尿嘧啶对照品储备液体，进行适当稀释后，在紫外可见分光光度计中进行光谱扫描，选择最佳检测波长，结果显示尿嘧啶在205 nm波长处有较强的吸收。另取尿苷对照品储备液体，进行适当稀释后，在紫外可见分光光度计中进行光谱扫描，选择最佳检测波长，结果显示尿苷在紫外区没有明显的吸收，这与文献所报道的结果相一致[7]。所以最终采用205 nm作为紫外光谱的检测波长。
流动相的选择：本次研究中尝试采用乙腈-水以及甲醇-水的不同比例作为流动相对尿嘧啶和尿苷含量进行测定，结果显示采用乙腈-水作为流动相，尿嘧啶和尿苷与色谱中其他组分分离效果更好。为了将流动相的比例调整到最优化状态，将乙腈-水比例分别设置为90∶10、93∶7、95∶5、97∶3，实验结果表明在乙腈-水(95∶5)时流动相洗脱效果最好，尿嘧啶和尿苷与相邻峰的分离度均能够达到2.0以上，且理论板数均能超过3 500。因此选择乙腈-水(95∶5)作为流动相。
尿嘧啶和尿苷线性关系的考察：取尿嘧啶对照品加溶剂分别制成含尿嘧啶0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0、20.0、50.0μg/m L的对照品溶液。按顺序依次进样10μL，记录色谱图，结果尿嘧啶在0.5～10.0μg/m L与峰面积呈良好线性关系。另取尿苷对照品加溶剂分别制成含尿苷0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0、20.0、50.0μg/m L的对照品溶液。按顺序依次进样10μL，记录色谱图，结果尿苷在0.5～10.0μg/m L与峰面积呈良好线性关系。实验表明尿嘧啶和尿苷均在0.5～10.0μg/m L与峰面积呈良好线性关系。
不同色谱柱的考察：选取Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)、Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)、Waters NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)3个不同厂家的色谱柱，柱长均为250 mm。本实验需采用氨基柱进行分析测定。结果表明尿嘧啶和尿苷色谱峰的对称性、分离度和理论塔板数无显著差异，均符合要求。
不同流速的考察：将“色谱条件”项下的流速分别设定为0.8、1.0、1.2 m L/min，进行考察实验。结果表明，各流速条件下，尿嘧啶和尿苷色谱峰的分离度均较好。
不同柱温的考察：分别在30℃、40℃和室温时进样分析。结果表明，在40℃条件下，尿嘧啶和尿苷色谱峰的对称性、分离度和理论塔板数最高。
不同产地炒土鳖虫中尿嘧啶和尿苷含量测定结果：分别选取安徽省亳州市、河北省安国市、山西省万荣县三个产地的样品进行测定，结果尿嘧啶的含量分别为0.43 mg/g、0.40 mg/g、0.48 mg/g，尿苷的含量分别为0.28 mg/g、0.32 mg/g、0.31 mg/g。
讨论
采用HPLC对炒土鳖虫中的有效成分尿嘧啶和尿苷进行测定，样品的处理过程较为简单，重现性良好，方法操作简单，结果准确，回收率高，可以作为评价中药炒土鳖虫中有效成分的质量方法。
参考文献
[1]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海科技出版社,1997:2684.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015:227.
[3]蔡少青.常用中药材品种整理和质量研究[M].北京:北京医科大学出版社,2003:222-264.
[4]杨金玲,张立国.土鳖虫炮制方法及质量问题分析[J].传统医药,2003,1(8):53.
[5]王丽娜,王颖,朱明珠.土鳖虫的活性成分及药理研究进展[J].化工时刊,2017,31(6):34-36.
[6]景晶,曹红.HPLC法测定土鳖虫中尿嘧啶和尿囊素的含量[J].药学实践杂志,2010,28(2):134-136.
[7]李洪,熊敏.高效液相色谱法测定土鳖虫中尿嘧啶、次黄嘌呤和尿苷含量[J].河南中医,2014,34(8):1634-1635.
[8]万丹,蔡萍,张水寒.土鳖虫超微粉体中尿嘧啶、次黄嘌呤的含量测定[J].湖南中医药大学学报,2011,31(9):36-40.