摘 要：目的 探讨SRT1720抑制巨噬细胞泡沫化与给药时间的关系。方法 将巨噬细胞RAW264.7种植于3个24孔细胞培养板，每个培养板分3组培养细胞，control组只加培养基，ox-LDL组加60μg/ml ox-LDL,ox-LDL+SRT1720组先加60μg/ml ox-LDL，分别培养不同时间（0、12、24 h）后再加入10μmol/L SRT1720干预，采用油红O染色和胆固醇测定，比较巨噬细胞泡沫化抑制情况。结果 与Control组比较，oxLDL组0、12、24 h胆固醇含量均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与ox-LDL组比较，ox-LDL+SRT1720组油红O染色中0、12 h油红染色比均减少，差异有统计学意义（P<0.05）,24 h油红染色比略减少，但差异无统计学意义（P>0.05）;ox-LDL+SRT1720组0 h胆固醇含量减少，差异有统计学意义（P<0.05）,12、24 h胆固醇含量略有减少，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论 在动脉粥样硬化早期给药，SRT1720抑制效果更佳。
关键词：SRT1720 动脉粥样硬化 泡沫化程度 氧化低密度脂蛋白
Experimental Study on the Optimal Administration Time of SRT1720 in Inhibiting the Foaming of Macrophages
JIANG Yi-hua WANG Qian CAI Jin-yu LYU Xue-yang WANG Qi ZHOU Xiao LI Jing-jing
School of Medical Imaging,Xuzhou Medical University;
Abstract：Objective To investigate the relationship between the suppression of macrophage foaming by SRT1720 and the administration time.Methods Macrophage RAW264.7 was planted on three 24 well cell culture plates. Each plate was divided into three groups to culture cells. Control group only added medium and oxLDL group added 60 μ g/ml ox-LDL, ox-LDL + srt1720 group, 60 μg/ml ox-LDL, cultured for different times(0,12, 24 h) and then added 10 μmol/L SRT1720 intervention, oil red O staining and cholesterol determination, compared macrophage foam inhibition situation. Results Compared with the control group, the cholesterol content in ox-LDL group increased at 0, 12 and 24 hours, the difference was statistically significant(P <0.05); Compared with ox-LDL group, the ratio of oil red O staining at 0 and 12 hours in ox-LDL + SRT1720 group decreased, the difference was statistically significant(P<0.05), and the ratio of oil red staining at 24 hours decreased slightly, but the difference was not statistically significant(P>0.05); The cholesterol content in ox-LDL + SRT1720 group decreased at 0 h, the difference was statistically significant(P <0.05), and decreased slightly at 12 and 24 h, but the difference was not statistically significant(P >0.05).Conclusion SRT1720 has a better inhibitory effect when administered in the early stage of atherosclerosis.
Keyword：SRT1720; Atherosclerosis; Degree of foaming; Oxidized low-density lipoprotein;
巨噬细胞泡沫化（macrophage foam）是动脉粥样硬化的重要因素，脂质的过量存积则是泡沫化的主要原因，减少细胞内己经存积的脂质对抑制泡沫化有重要作用[1-3]。去乙酰化酶1(SIRT1）通过减少泡沫细胞的形成阻止动脉粥样硬化[4-6]，使肝X受体（LXR）去乙酰化后可以上调后者的活性，促进胆固醇逆转运将胆固醇从细胞内排出，通过抑制早衰防止内皮功能紊乱。已证实SIRT1在巨噬细胞中可以降低动脉粥样硬化的发生。此外，还有研究发现SIRT1通过抑制NF-k B信号通路[7]降低凝集素样ox-LDL受体-1(Lox-1）的表达，从而降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的摄取[8,9]。SIRT1在稳定斑块、降低胆固醇摄取、抑制巨噬细胞泡沫化以及减轻炎症反应等方面的积极作用，使其成为防治动脉粥样硬化的新靶标。SRT1720是人工合成的SIRT1特异性激活剂，SRT1720通过与氨基末端催化区的变构位点结合，连接到SIRT1酶-肽底物复合物上，降低乙酰化底物的米氏常数值，从而激活SIRT1[10-13]。已有研究表明[14],SRT1720可以抑制巨噬细胞泡沫化，但是对于SRT1720的干预时间对巨噬细胞的泡沫化的抑制效果的影响报道罕见，本研究分别在巨噬细胞经ox-LDL干预不同时间后加入SRT1720，观察SRT1720的干预时间对治疗效果的影响，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及材料
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购于中国科学院细胞库（上海），氧化低密度脂蛋白ox-LDL购于上海源叶生物科技有限公司（上海），SIRT1激活剂SRT1720购于大连美伦生物科技有限公司（大连），油红O购于上海索桥生物科技有限公司（上海），总胆固醇测试盒购于南京建成生物工程研究所（南京）。
1.2 方法
将巨噬细胞RAW264.7种植于3个24孔细胞培养板，每个培养板分3组培养细胞，Control组只加培养基，ox-LDL组加60μg/ml ox-LDL,oxLDL+SRT1720组先加60μg/ml ox-LDL，分别培养不同时间（0、12、24 h）后再加入10μmol/L SRT1720干预，采用油红O染色和胆固醇测定，比较巨噬细胞泡沫化抑制情况。
1.2.1 油红O染色
细胞培养终止后，去掉原细胞培养液，PBS漂洗3次，5 min/次；用4%多聚甲醛室温下固定15 min，固定结束后PBS漂洗5 min×2次；取油红O储备液6 ml，加入蒸馏水4 ml配成油红O工作液，混合后静置10 min，滤纸避光过滤后配成油红O工作液，每孔加入油红O工作液200μl，避光染色40 min；蒸馏水洗10 s×2次，光镜下观察并拍照。
1.2.2 胆固醇含量测定
细胞培养结束，光镜下带200μm标尺拍照，随机取10个细胞，通过细胞与标尺的比例关系计算平均细胞直径，细胞密度取水的密度，由球体体积计算公式和细胞质量计算公式算出细胞质量；对细胞进行消化分离，制备细胞悬液并取出，1000 r/min，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀；用PBS清洗2次，取少量细胞悬液计数，计算每孔的细胞数量，计算细胞质量；清洗后以1000 r/min离心速度离心10 min；弃上清液，留细胞沉淀；加入0.2 ml无水乙醇进行匀浆，冰水浴条件下超声破碎（功率300 W,3 s/次，间隔9 s，重复5次），制备好的匀浆直接测定；准备96孔板，以样本工作液为1∶100比例混匀，每个样本3个平行组加入96孔板中；37℃孵育10 min，设置分光光度计波长510 nm，测定各管吸光度值；胆固醇含量（mmol/g组织）=（样本OD值-空白OD值）/（校准OD值-空白OD值）×校准品浓度（mmol/L）/待测样本质量浓度（g/L）。
1.3 统计学方法
油红O染色拍照结束后，采用Image J分析软件计算出染红区域面积和细胞总面积的比值，对油红O染色的巨噬细胞进行定量分析；采用spss 25.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，用沃勒-邓肯（W）法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 光镜下观察油红O染色处理组巨噬细胞泡沫化情况
o-x LDL组及ox-LDL+SRT1720组0、12、24 h细胞泡沫化程度均高于Control组，其中0 h加入SRT1720对巨噬细胞泡沫化的抑制效果最佳，见图1～图3。
2.2 油红O染色
2.2.1 ox-LDL处理不同时间加入SRT1720的巨噬细胞油红染色比
SRT1720直接干预可以显著抑制巨噬细胞的泡沫化，随着泡沫化程度的增加，药物的抑制效果呈递减趋势，见图4。
图1 ox-LDL与SRT1720同时干预后巨噬细胞的脂质沉积
图2 ox-LDL处理12 h后加入SRT1720干预后巨噬细胞的脂质沉积
图3 ox-LDL处理24 h后加入SRT1720干预后巨噬细胞的脂质沉积
图4 ox-LDL处理不同时间加入SRT1720的巨噬细胞油红染色比
2.2.2 各组细胞中油红染色脂质沉积比较
与Control组比较，ox-LDL组0、12、24 h油红染色比均增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与ox-LDL组比较，oxLDL+SRT1720组0、12 h油红染色比降低，差异有统计学意义（P<0.05),24 h组油红染色比略降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；巨噬细胞泡沫化后，SRT1720越早期给药其抑制效果越佳，见表1。
2.3 胆固醇测定
与Control组比较，ox-LDL组0、12、24胆固醇含量均增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与ox-LDL组比较，ox-LDL+SRT1720组0 h胆固醇含量减少，差异有统计学意义（P<0.05),12、24 h胆固醇含量均略减少，但差异无统计学意义（P>0.05）；在巨噬细胞刚开始泡沫化时SRT1720给药有抑制效果，见表2。
表1 各组细胞中油红染色脂质沉积比较（±s,%)
表2 各组细胞中胆固醇含量比较（±s,mmol/g)
3 讨论
动脉粥样硬化是慢性炎症性、严重危害人类健康的疾病，而脂质氧化在动脉粥样硬化的形成与发展过程中起着重要作用。有研究表明[2]，巨噬细胞参与了动脉粥样硬化的全过程，是泡沫细胞形成过程中的关键因素；另有研究报道[14]，在兔主动脉晚期动脉粥样硬化病灶中大约45%的细胞，在人冠状动脉粥样硬化病灶中超过50%的细胞属于VSMC来源，且多于巨噬细胞。血液中的单核细胞会在血管内皮受损的情况下通过内皮间隙，然后在内膜下转化为巨噬细胞，巨噬细胞可以介导渗入血管内皮下的低密度脂蛋白（LDL）发生氧化修饰，最终形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。巨噬细胞吞噬大量ox-LDL，导致细胞内脂质堆积，最终形成泡沫细胞。因此，减少胆固醇的流入或增加其流出对减少动脉粥样硬化的发生具有十分重要的意义。
已有研究表明，SIRT1是去乙酰化酶家族（SIRT1-7）的一员，在维持细胞能量、脂质代谢及葡萄糖稳态等方面发挥重要作用[7]。近年来，SIRT1在动脉粥样硬化防治方面的保护作用逐渐受到研究者的关注。SRT1720是人工合成的SIRT1特异性激活剂，通过与氨基末端催化区的变构位点结合，连接到SIRT1酶-肽底物复合物上，降低乙酰化底物的米氏常数值，从而激活SIRT1。曹小洁等[7]的研究已证明SRT1720可以抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞的形成，但是对其最佳的给药时间尚无研究。为了提高药物的利用率和降低药物对人体的伤害，不同时期的动脉粥样硬化治疗应该对应不同的药物。SRT1720具有一定的毒性，因此通过设定准确的服药时间，不仅可以给获得较好的治疗效果，还能降低不必要用药给人体带来的危害。
本研究采用在同等操作环境下，巨噬细胞经ox-LDL处理不同时间SRT1720给药，比较巨噬细胞泡沫化的抑制情况。油红O染色和胆固醇测定结果显示，ox-LDL干预时间越久，其泡沫化程度越高，ox-LDL与SRT1720同时加入可以显著抑制巨噬细胞的泡沫化，由此推测动脉粥样硬化在此时期给予SRT1720治疗，几乎可以完全抑制巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取。而随着泡沫化程度的增加，相同量的SRT1720抑制巨噬细胞泡沫化的效能有所降低。因此推测SRT1720可以抑制巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄入，对已经泡沫化的巨噬细胞发生逆向转变的效果并不明显。
研究显示[15]，在动脉粥样硬化早期发现疾病的患者较少，动脉粥样硬化疾病早期病理变化和特征性标志是斑块内泡沫巨噬细胞的浸润，泡沫细胞的数量和分布是引起斑块不稳定性的重要发病基础，与临床急性心血管事件的发生呈显著相关。有研究试图通过影像学手段，实现对动脉粥样硬化易损斑块形态和成分性质的早期可视化诊断[16]，经过诊疗一体化纳米粒子[17]的预治疗，可以降低血管完全堵塞的风险。尤其是对斑块内泡沫巨噬细胞进行早期识别及动态定量监测，对于预防急性心脑血管事件的发生具有重要意义，因此诊疗一体化纳米探针的制备在预防动脉粥样硬化斑块形成的研究具有重要意义。
综上所述，SRT1720对于动脉粥样硬化的早期治疗效果最好。如果可将其制成纳米探针，对斑块内泡沫巨噬细胞进行早期靶向诊断治疗。由于研究表明对于中晚期的动脉粥样硬化巨噬细胞泡沫化抑制情况并不明显，因此其治疗方法及加药量尚不明确。SRT1720对巨噬细胞泡沫化的影响还有待进一步研究，可能对于提高其临床的治疗效果具有重要意义。
[1]Yazgan B,Sozen E,Karademir B,et al.CD36 expression in peripheral blood mononuclear cells reflects the onset of atherosclerosis[J].Biofactors,2018,44(6):588-596.
[2]徐芳,蒙颖,王志禄,等.罗格列酮对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量及SR-BⅠ表达的影响[J].南方医科大学学报,2012,32(12):1792-1795.
[3]Zhang MJ,Zhou Y,Chen L,et al.SIRT1 improves VSMC functions in atherosclerosis[J].Prog Biophys Mol Biol,2016,121(1):11-15.
[4]Zhao L,Varghese Z,Moorhead JF,et al.CD36 and lipid metabolism in the evolution of atherosclerosis[J].Br Med Bull,2018,126(1):101-112.
[5]Lin M,Xu X,Lee HL,et al.Fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia due to anti-CD36 antibodies:antibody evaluations by CD36-transfected cell lines[J].Transfusion,2018,58(1):189-195.
[6]Stein S,Lohmann C,Schafer N,et al.SIRT1 decreases Lox-1-mediated foam cell formation in atherogenesis[J].Eur Heart J,2010,31(18):2301-2309.
[7]曹小洁,张明杰,张莉莉,等.SIRT1通过抑制NF-κB信号通路而抑制oxLDL诱导的VSMC源性泡沫细胞形成[J].四川医学,2019,40(5):449-453.
[8]Zeng HT,Fu YC,Yu W,et al.SIRT1 prevents atherosclerosis via liver-X-receptor and NF-κB signaling in a U937 cell model[J].Mol Med Rep,2013,8(1):23-28.
[9]Mitchell SJ,Martin-Montalvo A,Mercken EM,et al.The SIRT1 activator SRT1720 extends lifespan and improves health of mice fed a standard diet[J].Cell Rep,2014,6(5):836-843.
[10]Luo G,Jian Z,Zhu Y,et al.Sirt1 promotes autophagy and inhibits apoptosis to protect cardiomyocytes from hypoxic stress[J].Int J Mol Med,2019,43(5):2033-2043.
[11]Liu B,Lei M,Hu T,et al.Inhibitory effects of SRT1720 on the apoptosis of rabbit chondrocytes by activating SIRT1 via p53/bax and NF-κB/PGC-1αpathways[J].J Huazhong Univ sci Technolog Med Sci,2016,36(3):350-355.
[12]Wan X,Wen JJ,Koo SJ,et al.SIRT1-PGC1α-NFκB Pathway of Oxidative and Inflammatory Stress during Trypanosoma cruzi Infection:Benefits of SIRT1-Targeted Therapy in Improving Heart Function in Chagas Disease[J].PLoS Pathog,2016,12(10):e1005954.
[13]Wen J.SRT1720 inhibition of M1 macrophages and chronic inflammation in Chagas disease[J].The Journal of Immunology,2016,196(1):124.
[14]Allahverdian S,Chehroudi AC,McManus BM,et al.Contribution of intimal smooth muscle cells to cholesterol accumulation and macrophage-like cells in human atherosclerosis[J].Circulation,2014,129(15):1551-1559.
[15]Das D,Sivasubramanian K,Yang C,et al.On-chip generation of microbubbles in photoacoustic contrast agents for dual modal ultrasound/photoacoustic in vivo animal imaging[J].Sci Rep,2018,8(1):6401.
[16]刘仁凤,赵阳,窦寅,等.炎症微环境响应性仿高密度脂蛋白纳米药物的构建及其体外抗动脉粥样硬化作用评价[J].第三军医大学学报,2020,586(11):6-14.
[17]Zheng M,Zhao P,Luo Z,et al.Robust ICG theranostic nanoparticles for folate targeted cancer imaging and highly effective photothermal therapy[J].ACS Appl Mater Interfaces,2014,6(9):6709-6716.