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LFLIU联合载不同抗结核药纳米粒对耻垢分枝杆菌的损伤效应及机制实验研究

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  • 更新时间2021-09-18
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  摘    要:目的 比较研究低频低强度超声(LFLIU)联合载左氧氟沙星纳米粒(LEV-NPs)和载利福平纳米粒(RIF-NPs)对耻垢分枝杆菌(MS)的杀菌效果及机制。方法 采用双乳化法制备LEV-NPs和RIF-NPs,检测其物理特性等。用频率42 KHz、强度0.45 W/cm2的超声联合LEV-NPs和RIF-NPs辐照MS悬液15 min,检测辐照后MS的活性及观察辐照前后细菌形态、结构变化及研究相关机制。结果 (1)制备的LEV-NPs和RIF-NPs粒径大小均匀、呈球形,Zeta电位均为负电荷。(2)与对照组相比,LFLIU联合两种载药纳米粒与MS悬液作用后24 h,平板计数细菌存活显著低于其他实验组(P<0.001)。透射电镜显示对照组和非超声组MS细菌壁未见明显损伤,在US+LEV-NPs组中,可见MS细菌壁破裂、结构不完整。(3)LFLIU联合LEV-NPs辐照MS后,共聚焦显微镜结果表明US+LEV-NPs组产生的活性氧(ROS)显著增加。结论 LFLIU联合两种载药纳米粒对MS均有显著的协同抗菌作用,且具有声敏性的LEV-NPs联合LFLIU能促进ROS的产生,达到高效杀菌效果。

  

  关键词:低频低强度超声 耻垢分枝杆菌 抗结核药物 纳米粒 协同杀菌

  

  Experimental Study on the Damage Effect and Mechanism of LFLIU Combined with Different Anti-tuberculosis Drug Nanoparticles on Mycobacterium Smegmatis

  

  Li Jianhu Li Gangjing Zhang Zhifei Du Yonghong

  

  State Key Laboratory of Ultrasound in Medicine and Engineering, College of Biomedical Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory of Biomedical Engineering;

  

  Abstract:Objective To compare the bactericidal effect and mechanism of low frequency low intensity ultrasound(LFLIU) combined with levofloxacin nanoparticles(LEV-NPs) and rifampicin nanoparticles(RIF-NPs) against Mycobacterium smegmatis(MS). Methods LEV-NPs and RIF-NPs were prepared by double emulsification method, and examined for their physical properties. The MS suspensions were irradiated with ultrasound at a frequency of 42 kHz and an intensity of 0.45 W/cm2 in combination with LEV-NPs and RIF-NPs for 15 min. The activity of MS after irradiation was examined and the morphological and structural changes of bacteria before and after irradiation were observed and the mechanisms involved were studied. Results(1)The prepared LEV-NPs and RIF-NPs were uniform in particle size and spherical in shape, and both had negative Zeta potential.(2)Compared with the control group, the survival of bacteria in plate counts was significantly lower(P<0.001) in the LFLIU combined with both drug-loaded nanoparticles after the interaction with MS suspension for 24 hours. Transmission electron microscopy showed no significant damage to the MS bacterial wall in the control and non-ultrasound groups, while a breakdown and structural incompleteness of the MS bacterial wall was seen in the US(ultrasound)+LEV-NPs group.(3)After LFLIU combined with LEV-NPs irradiated MS, the results of laser confocal scanning microscopy showed a significant increase in the production of reactive oxygen species(ROS) in the US+LEV-NPs group. Conclusions LFLIU combined LFLIU combined with both drug-loaded nanoparticles showed significant synergistic antibacterial effects on MS, and the sound-sensitive LEV-NPs combined with LFLIU promoted the production of ROS to achieve efficient bactericidal effects.

  

  Keyword:Low-frequency and low-intensity ultrasound; Mycobacterium smegmatis; Anti-tuberculosis drugs; Nanoparticles; Synergistic sterilization;

   

  结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的高度传染性慢性疾病。目前,结核病常用多种药物联合治疗,但治疗周期长(6~24个月)、副作用大[1]。患者的依从性差,导致耐药MTB的出现使临床治疗非常困难[2]。因此,结核病治疗迫切需要新的治疗方式。低频低强度超声(low frequency and low intensity ultrasound, LFLIU)联合纳米递送系统有效提高抗生素在体内外对浮游细菌、细菌生物膜、衣原体等杀菌[3-4]。本实验比较研究LFLIU联合具有抗结核和声敏二重性的左氧氟沙星(levofloxacin, LEV)及抗结核药利福平(rifampicin, RIF)对结核分枝杆菌的生物模式菌株耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis, MS)的杀菌效果,有望为耐药结核菌的治疗提供新方法。

  

  资料与方法

  

  1. 主要试剂及仪器

  

  聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-COOH)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)、左氧氟沙星、利福平、Middlebrook 7H9肉汤基础培养基、MS菌株(中国生物鉴定所)、活性氧检测试剂盒、低温真空干燥机、低频低强度超声(苏州海纳科技有限公司)、sonics & materials声震仪、Zeta Size 3000HS马尔文粒度仪、Hitachi SU8010扫描显微镜、JEOL JEM-1400PLUS透射电子显微镜、Nikon A1R 激光共聚焦显微镜等。

  

  2. 实验方法

  

  ①耻垢分枝杆菌(MS)培养及最小抑菌浓度(MIC)的测定

  

  将MS菌株在新鲜的Middlebrook 7H9培养基中培养至OD600为0.5~1,并稀释至OD600为0.05。使用美国临床实验室标准委员会推荐的方法分别测定两种抗结核药对MS的MIC。

  

  ②纳米粒的制备及检测

  

  采用双乳化法[5]制备载左氧氟沙星纳米粒(levofloxacin nanoparticles, LEV-NPs)与载利福平纳米粒(rifampicin nanoparticles, RIF-NPs)。用马尔文粒度分析仪测定纳米粒子的基本物理特性,用扫描电镜观察纳米粒的形貌和结构,纳米粒的载药率和包封率分别用如下公式计算:

  

  载药率(%)=(纳米粒中药物的含量/纳米粒的总重量)×100%

  

  包封率(%)=(纳米粒中药物的重量/投入药物的总重量)×100%

  

  ③实验分组及超声辐照方式

  

  MS菌液培养24 h后将生长至指数期,分为对照组、RIF组、RIF-NPs组、LEV组、LEV-NPs组、超声组(ultrasound, US)、US+RIF组、US+RIF-NPs组、US+LEV组和US+LEV-NPs组,各组用频率为42 KHz, 强度为0.45 W/cm2的超声辐照时间15 min。

  

  ④MS活性及活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测

  

  将各组实验处理后的MS,进行平板计数观察细菌的活性。并按照常规方法处理后,送电镜室制样观察。用活性氧检测试剂盒DCFH-DA探针测定不同处理后MS菌体内ROS含量。

  

  3. 统计学方法

  

  数据用(x¯±s)表示,统计分析使用GraphPad Prism8.0。两组数据之间的比较使用t检验,多组数据之间使用单因素方差分析,P<0.05被认为具有统计学意义。

  

  结 果

  

  1. 两种载药纳米粒的合成与物理特性

  

  扫描电子显微镜观察所制备的两种纳米粒呈大小均匀的球形,分散性好,见图1。采用马尔文纳米粒度仪测量平均粒径、Zeta电位和聚合物分散指数(polymer dispersity index, PDI)结果,见表1。

  

  图1 载药纳米粒的粒径及电镜图(×70k)

  

  2. LFLIU联合两种载药纳米粒对MS活性及结构的影响

  

  LFLIU联合两种载药纳米粒(LEV-NPs中LEV浓度为2 μg/mL,RIF-NPs中RIF浓度为16 μg/mL)辐照MS后平板计数法观察活菌计数结果,见图2,结果显示在没有LFLIU辐照的情况下,单独药物组的细菌生长较对照组均受到一定的抑制,在超声联合载药纳米粒的作用下,RIF-NPs和LEV-NPs组细菌生长显著降低,且与超声联合单独药物相比有显著统计学差异(P<0.001)。

  

  图2 MS菌落平板计数

  

  各组实验后24 h, 透射电镜观察MS的结构损伤情况,见图3,结果显示对照组和非超声组细菌细胞壁完整,未见明显损伤。载药纳米粒组中菌体内可见载药纳米粒存在(红色箭头所示)。与对照组相比,超声组中MS有大量脂滴空泡出现(黑色箭头所示),表明超声增加了细菌壁的通透性[6]。在超声联合载药纳米粒组中可以看到细菌细胞壁破裂(黄色色箭头),细胞结构不完整,且超声联合LEV-NPs组中细菌明显肿胀,有大量死细菌菌体碎片存在。表明超声可以有效增加纳米粒的递送,使纳米粒有效进入MS菌体内。在超声的作用下激活LEV的声敏性进一步协同杀菌。

  

  3. LFLIU联合两种载药纳米粒对MS的杀菌机制

  

  通过激光共聚焦检测的MS菌体内荧光强度可间接测得菌内ROS水平。共聚焦显微镜结果显示US+LEV-NPs组的绿色荧光显著高于其他组,说明LFLIU联合LEV-NPs产生了大量ROS物质,见图4,表明LEV-NPs杀菌效果优于RIF-NPs的主要区别是在超声介导下激活了具有抗结核与声敏双重性的LEV产生ROS,从而达到对MS的高效杀菌作用。

  

  讨 论

  

  声动力学疗法(sonodynamic therapy, SDT),是将超声与声敏剂有效结合产生声毒性和ROS,杀伤病变细胞,从而有效治疗疾病[7-8]。本研究成功制备了两种载抗结核药物纳米粒。比较了LFLIU联合两种不同载抗结核药纳米粒对MS的损伤效应,结果显示在最低抑菌浓度的药物含量中,LFLIU联合两种载药纳米粒对MS都有明显的杀菌效果,但LFLIU联合LEV-NPs杀菌效果显著,表明临床上结核病药物治疗失败主要与药物难到达菌体内有关。

  

  表1 两种载药纳米粒的物理特性

  

  图3 不同处理组透射电镜图(×30k)

  

  图4 共聚焦显微镜观察不同方式处理后耻垢分枝杆菌(MS)菌体中活性氧产量产生(比例尺为50 um)

  

  Oehlerssh等[9]报道了通过改变结核肉芽肿内血管的通透性,调控微环境治疗结核病的新策略,但还是没有从根本上解决抗结核药高效达到MTB内的问题。课题组前期[10]已经证实LFLIU能促进纳米粒的渗透,提高药物到达菌体内的浓度。本研究也证实了喹诺酮类抗菌药物LEV等具有声动力活性[11-12],在相同的抑菌浓度之下,LFLIU联合LEV与LEV-NPs的杀菌效果明显高于RIF与RIF-NPs组,其原因与LFLIU联合LEV-NPs一方面充当空化核增加超声空化;另一方面在“声孔效应”下细胞壁被短暂打开使得纳米粒被高效的递送到MS 菌体中,作为声敏剂的LEV在超声的存在下被激活产生 ROS等物质,进一步增加了对MS的损伤作用。

  

  为了进一步研究LEV-NPs的杀菌机制,对不同处理组产生ROS的能力进行了比较研究,结果表明US+LEV组和US+LEV-NPs组有绿色荧光,而US+LEV-NPs组的绿色荧光显著高于其他组,这也进一步证实了LEV具有抗结核和声敏性双重作用。这一结果有望为耐药结核病的逆转治疗提供新的方案。

  

  结 论

  

  LFLIU联合载药纳米粒对MS均有显著的协同抗菌作用,LEV作为声敏剂联合LFLIU能显著降低MS的存活率,有望为肺外实体性结核病灶的治疗奠定基础。

  

  参考文献

  

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