摘 要：目的 研究宫内慢性缺氧对成年期雄性心肌细胞内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）表达和磷酸化水平的不良作用。方法 健康SD孕鼠于孕期第7天随机分为缺氧组（21%O2,n=6）、对照组[（10.0±0.5）%O2,n=6]，缺氧组于低氧舱内进行缺氧暴露，每日维持8 h。重复上述过程直至孕鼠分娩（妊娠第21天）。选取子代雄性大鼠各6只，正常喂养至11月龄。蛋白质印迹法测定成年雄性大鼠心肌细胞的3个位点表达，即e NOS、e NOS苏氨酸495位点（Threonine 495 loci,Thr495）、eNOS丝氨酸1177位点（Serine1177 loci,Ser1177）。结果 与对照组相比，宫内缺氧组心肌细胞eNOS蛋白水平表达[（1.032±0.185）vs.(1.473±0.141)]、eNOS Ser1177磷酸化程度[（0.239±0.078）vs.(0.672±0.087)]均减少，而eNOS Thr495磷酸化程度[（0.638±0.149）vs.(0.208±0.109)]上升（P均<0.001）。结论 宫内慢性缺氧下调心肌细胞e NOS蛋白、eNOS Ser1177的表达；上调心肌细胞eNOS Thr495表达。
关键词：内皮型一氧化氮合酶 宫内慢性缺氧 eNOS丝氨酸1177位点 磷酸化 eNOS苏氨酸495位点
有前沿学者曾调研过流行病学特征，不健康子宫内环境对胎儿期的影响会导致儿童期易患疾病外，还会增加成人时期感染非传染性疾病的风险[1]。如果胎儿持续暴露于不利的宫内环境，包括氧气和营养因素，会使生理系统复位，导致心肌细胞数量和表观遗传的改变，从而导致成年后心血管疾病[2-3]。作为一氧化氮合酶的亚型之一，e NOS在引起心血管疾病的同时，若e NOS表达下降或生物活性下降，可引起血管内皮功能障碍[4]。磷酸化调控会干扰e NOS的活性在转录、翻译阶段，尤其是丝氨酸1177位点（Ser1177）和苏氨酸495位点（Thr495)2个位点[5]。本研究在前人基础上，通过研究e NOS分子活性修饰途径即磷酸化的改变，以期探索面对宫内缺氧时e NOS活性改变的相应分子机制及成人疾病编程的研究。
1 材料与方法
1.1 缺氧模型建立与分组
由上海斯莱克实验动物公司提供清洁级SD雌性孕鼠12只，孕龄7 d，通过随机数字表随机分为缺氧组与对照组（各n=6）。建立宫内慢性缺氧模型，6只孕鼠置于缺氧舱内，每日8 h持续缺氧，箱内氧浓度为（10.0±0.5）%。常氧对照组的6只孕鼠也置于相同的玻璃箱内，持续通入空气[6]。
1.2 动物标本采集
按随机数字表法在生产后于每窝刚生产后的大鼠里选取1只雄性，经过11个月的饲养，到实验结束时，对照组有6只存活，缺氧组有5只存活。将动物麻醉之后迅速取出心脏，仅保留室间隔及左心室，固定于10%的甲醛溶液，脱水、包埋室温备用，余标本液氮中速冻后转存于-80℃冰箱备检。
1.3 Western Blot法测定e NOS、e NOS(Thr495）、e NOS(ser1177）表达
配置试剂后组织切块加入裂解液，待充分裂解后进行离心取上清，用考马斯亮蓝法测定各细胞样本蛋白含量，进行蛋白样品变性、电泳，封闭1 h后用一抗用封闭液稀释（内参抗体稀释度为1∶1 000），洗膜后将一抗反应膜放入二抗工作液中，用image J软件分析灰度值（抗体及试剂盒分别由美国Zymed Laboratories公司、江苏厚普生物公司提供）。
1.4 统计方法
使用spss22.0统计软件对数据进行分析：计量资料用（±s）描述，行t检验。当P<0.05时，表示存在统计学差别。
2 结果
Western Blot法测定e NOS、Ser1177、Thr495表达结果以Western Blot依次检测e NOS、Thr495、Ser1177表达（图1）。可见Thr495位点磷酸化程度有所升高而Ser1177位点磷酸化程度有所降低（图2）。
图1 Western Blot法检测e NOS、Thr495、Ser1177表达
图2 Western Blot法测定e NOS、Ser1177、Thr495表达结果
3 讨论
目前认为宫内慢性缺氧通常以变动e NOS及其分子伴侣，如CAV-1、HSP90、血清内皮素-1、CAM的表达，从而导致成人发生心血管疾病[7-8]。作为调控e NOS活性的重要途径之一，宫内慢性缺氧过程中的e NOS磷酸化尚未见报道。
本研究发现，宫内慢性缺氧将导致雄性成年期出现e NOS蛋白表达下降，故提示宫内慢性缺氧对机体作用时间长，效果显著，e NOS表达降低后会减少NO生成，心血管系统没有NO的保护作用，会从胎儿期一直持续到中年，这可能是控制成人慢性宫内缺氧所致心血管疾病发生的机制[9-10]。
e NOS在翻译后修饰阶段有着复杂的模式，蛋白激酶与蛋白磷酸酶传导的去磷酸化及磷酸化网络充当对e NOS活性进行调节的重要翻译后修饰[11-12]。磷酸化程度则直接影响e NOS与钙调蛋白的结合力[13-14]。一方面蛋白激酶-B、蛋白激酶-A和钙调蛋白都能在Ser1177位点磷酸化e NOS，从而增强e NOS与钙调素的结合。另一方面，此外，蛋白激酶-A和蛋白激酶-C通道传导THR495位点的e NOS磷酸化受到抑制，影响其和Ca M结合在一起。细胞受刺激之后往往引发Thr495迅速去磷酸化，以推动Ca M与e NOS结合生成NO。故e NOS活性与Ser1177和Thr495互相之间的磷酸化/去磷酸化程度相关。
综上所述，慢性宫内缺氧可显著下调成年雄性大鼠心肌细胞e NOS蛋白和e NOS Ser1177的表达，上调成年雄性大鼠心肌细胞e NOS Thr495的表达。
参考文献
[1]隽娟,杨慧霞.孕前及孕期营养促进母婴远期健康的推荐[J].中国医刊,2019,54(11):1173-1176.
[2]李祖福.产前缺氧对成年雄性子代大鼠心肌细胞eNOS、CaM和Cav-1表达的影响[D].福州:福建医科大学,2019:31.
[3]李雅雅,吕国荣,林惠通,等.慢性宫内缺氧子代主动脉差异micro RNA表达谱研究[J].中国妇幼保健,2019,34(16):3809-3812.
[4]王珅,王丹.运动的血管内皮效应及其分子机制[J].心血管康复医学杂志,2019,28(5):670-672.
[5]史清海,葛迪,伏建峰.缺氧与血管内皮eNOS基因转录调控的研究进展[J].解放军医药杂志,2019,31(9):108-111,116.
[6]徐小洁,余鸿.宫内缺氧对幼年大鼠海马CA3区SYN、Jmjd6的表达与学习、记忆能力的影响[J].卫生职业教育,2020,38(3):104-106.
[7]罗明昊,胡舒鹏,王瑞钰,等.IL-1β通过抑制AKT下调人脐静脉内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化水平[J].中国病理生理杂志,2020,36(10):1739-1744.
[8] Daban KL,Sevilay T,Tugba G,et al.Amplitude-integrated electroencephalographic activity and middle cerebral artery Doppler flow measurements in preterm small for gestational age infants[J].J Child Neurol,2015,30(4):412-416.
[9]刘丹,周文婷,艾尼瓦尔·吾买尔,等.性别与雌激素水平对肾血管性高血压大鼠肾素-血管紧张素系统组分蛋白和基因表达的影响[J].中国临床药理学杂志,2020,36(9):1092-1095.
[10] Arthur EW,王英姿.蛋白质磷酸化对衣原体生理学影响的研究进展[J].中国免疫学杂志,2021,37(2):241-244.
[11]李雅雅,吕国荣,林惠通,等.慢性宫内缺氧子代主动脉差异micro RNA表达谱研究[J].中国妇幼保健,2019,34(16):3809-3812.
[12]李祥.孕期慢性缺氧和出生后高脂饮食对子代血压的影响及动脉平滑肌离子通道机制研究[D].苏州:苏州大学,2019.
[13]黄煌,林迳苍,吕国荣,等.子宫内慢性缺氧对子代大鼠胰腺Pdx-1基因表观遗传机制改变的研究[J].中华妇幼临床医学杂志(电子版),2016,12(06):672-679.
[14]徐洁欢,李耀军,夏小艳.宫内慢性缺氧对子代大鼠心肌内皮素-1和去甲肾上腺素表达的影响[J].中国社区医师,2018,34(13):5,7.