刘燕文 曾少芳 吴龙章
【摘要】目的探讨液基夹层杯法、荧光染色法和抗酸染色法检测痰液分枝杆菌的应用价值。方法应用液基夹层杯法、荧光染色法和抗酸染色法分别检测311例临床痰液标本，统计分析3种不同方法的分枝杆菌阳性检出率。结果
夹层杯法、荧光染色法和抗酸染色法的阳性检出率分别为15.8%、20.9%、11.9%，其中荧光染色法阳性检出率最高，且操作简单快速，夹层杯法次之，抗酸染色法阳性检出率最低。结论总体来说，荧光染色法操作简单、快速、阳性率较高，是直接检测痰液分枝杆菌比较理想的方法。
【关键词】夹层杯法 金胺O荧光染色 抗酸染色 分枝杆菌
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2014.11.032
结核病是对人类最具威胁性的感染性疾病之一，是单病因所致的感染性疾病中病死率最高的疾病。在我国，结核病仍是一个严重的公共卫生问题，据WHO估算每年新发活动性肺结核患者130万例，其中传染性肺结核58万例，病原学检查是发现传染源、诊断和治疗结核病的关键［1］，是结核病诊断和化疗方案的重要依据。痰液中结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis, MTB）培养虽为肺结核诊断的金标准，但出结果时间需要２个月左右，周期太长，难以满足临床需要。因此，快速简单、灵敏准确的细菌学检查方法研究成为国内外学者所关注的课题［2］。本研究通过液基夹层杯法，直接涂片法的金胺O荧光染色法（简称荧光法）和直接涂片法的抗酸染色法（简称抗酸法）对疑似肺结核患者痰液标本进行检测，并对三种不同方法的阳性检出率进行比较，以评价3种不同方法在结核病诊断中的应用价值，现报告如下。
1材料与方法
1.1临床资料
311份痰液标本均来源于广州市胸科医院住院和门诊就诊患者，其中243例为确诊结核，68例为其他，包括肺炎25例，肺气肿23例，支气管扩张症20例。同时以结核分枝杆菌标准株H37Rv为质控菌株。
1.2材料
TQ-12自动离心涂片机，快速干片机，夹层杯均购自天骑医学新技术有限公司；药物振荡器购自常州诺基仪器有限公司；ZEISS荧光显微镜，OLYMPUS电子显微镜。分枝杆菌抗酸染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。金胺O荧光染色剂参照有关文献配制［3］。
1.3实验方法
对每例痰液标本同时采用液基夹层杯法、直接涂片法荧光染色法和直接涂片法抗酸染色法进行检测。直接涂片法参照中国结核病防治规划《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》操作［4］ 。荧光染色方法操作如下，将痰涂片用荧光染液染10 min，水洗后用5%盐酸酒精脱色1～2 min至外观无黄色为止，水洗后用反衬液染1～2 min，水洗后晾干待检。液基夹层杯法的操作方法如下，①消化：取痰1~2 ml，加入2~4倍标本量消化液，轻摇。吸取消化好的标本5 ml于夹层杯-Ⅰ 中，盖紧杯盖，至震荡器震荡3 min后，4 500 r/min，离心5 min。②固定：取出夹层杯-Ⅰ ，去掉上清液，烘干水份，加无水乙醇固定数秒。③染色:加抗酸染色液A，于干片机内加温至60 ℃ 保持5 min，流水沿杯壁冲洗，沥干。滴加B液，脱色至无色，流水冲洗，沥干。滴加C液，染色1~3 min，水洗，烘干。④封片镜检：取片针将夹层杯-Ⅰ 内基片顶出,夹出基片,烘干,标本面向下,用中性胶封片镜检。
1.4统计学处理
采用spss 17统计软件进行统计学分析，采用X2检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
液基夹层杯法、直接涂片法的荧光染色和抗酸染色的阳性率分别为15.8%（49/311）、20.9%（65/311）和11.9%（37/311）。三种方法阳性率比较，结果见表1。
3讨论
一百二十多年前，由德国科学家ROBERT ·KOCH所创立的直涂法至今仍然是结核病细菌学实验室诊断的主要方法之一。相对于临床和实验室的其他诊断方法来说，直接涂片找抗酸杆菌法具有特异性高、技术相对简单、成本低廉和报告时间短等优势［2］。直接涂片法中的荧光染色法和抗酸染色法的原理相同，都是利用了MTB的嗜石炭酸性，在染色剂中加入了石炭酸作为媒染剂。而荧光染色是加热后荧光染料渗入抗酸杆菌菌体内，从而使抗酸杆菌呈现继发荧光。如表所示，同是直接涂片法的荧光染色阳性率（20.9%）明显高于直涂法的抗酸染色的阳性率（11.9%）。究其原因，一是某些长期服用药物的患者其MTB的抗酸性被破坏但荧光染色性仍保留，结果在抗酸染色中为阴性，而在荧光染色中呈阳性［5］。另一原因是荧光染色中亮绿色荧光的MTB与暗色背景对比明显，不易漏检。由于荧光染色仅需要在40×的高倍镜下观察，视野较大，对阴性的判读只需选择50个视野内未发现杆菌即可，显著加快了判读速度，使报告结果变得简单、快捷［6］。而抗酸染色阳性的MTB与背景对比不太明显，杂质较多，容易漏检，标准操作中要求在显微镜下寻找300个视野看不到MTB才能报告MTB阴性。用普通显微镜长时间镜检容易造成观察者视觉疲劳， 相比之下荧光镜检不易视觉疲劳，因而有明显优势。
液基夹层杯法作为近年来开展的新方法而受到广泛的关注［2，5］，其原理是使用特制的消化液消化痰液，并高速震荡，使痰液标本充分液化而有利于其中的抗酸杆菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，再进行抗酸染色、读片。因此基于液基夹层杯法检测MTB，具有集菌效果，因而其阳性率比抗酸染色法要高，我们的研究结果也与有关学者的报道结果基本一致［2］。由于液基夹层杯法操作时破坏了背景细胞，造成整个观察视野均为白色背景，比较刺眼，不利于观察者的观察，反而更容易漏检。而其染色也是采用抗酸染色，不利于抗酸性被破坏但荧光染色性仍保留的MTB患者的检出。所以液基夹层杯法的阳性率（15.8%）也是明显低于直接涂片法荧光染色的阳性率（20.9%）。我们的调查结果显示平均每张抗酸染色法的阅片时间为4.5 min，平均每张荧光染色法的阅片时间为2 min，荧光染色法的阅片时间明显低于抗酸染色法而具有较大优势，能减轻观察者负担，并能为患者及早和准确地提供实验室检查结果，荧光染色法在工作量大的地区优势更加明显。在经济效益上考虑，开展液基夹层杯法需要配备自动离心涂片机、快速干片机、药物振荡器、电子显微镜、抗酸染液以及每份标本一个的夹层杯;而直涂法荧光染色只需配备荧光显微镜、荧光染液可自行配制。从长远计，直涂法荧光染色的经济效益要比液基夹层杯法的高。
综上所述，我们认为：我国结核病疫情严重，迫切需要快速、简单、高效率的检测方法对MTB进行快速诊断，以利于疫情控制及患者治疗。综合考虑，直接涂片法的荧光染色具有快速、简单、检出率高、成本比液基夹层杯法低廉且阳性率比后者高的优势，具有推广应用价值。
［1］刘晓燕,林健雄,郑惠聪,等.三种方法组成的结核病快速诊断技术的评价［J］.现代医院, 2011,11(7):33-35.
［2］刘海波,邵玉.3种检测痰抗酸杆菌方法的比较研究［J］.检验医学与临床,2012,8(9):1548.
［3］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程［M］.中国教育文化出版社,2006:30-37.
［4］中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程［J］.中国防痨杂志,1996,18(1):28 -31.
［5］齐兴峰,曾德华,郑智勇.金胺O荧光染色和抗酸染色在结核病诊断中的联合应用［J］.临床与实验病理学杂志,2010,26(6):763-764.
［6］张小芬,曾希鹏,刘平.荧光染色LED显微镜查找痰中结核杆菌的应用［J］.中国卫生检验杂志,2010,20(12):3286-3287.