摘 要：目的：探讨基于GCN2-elF2α-ATF4-NLRP3信号传导通路对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响及其作用机制。方法：选取北京维通利华实验动物技术有限公司提供的36只CD-1小鼠为研究对象，将小鼠随机分为假手术组（不插入线栓）和模型组（制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型），各18只。比较两组小鼠神经行为评分、缺血梗死面积，小鼠脑组织病理学，小鼠脑组织GCN2、eIF2α、ATF4及NLRP3蛋白表达情况及脑组织和血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。结果：模型组小鼠神经行为评分、脑损伤面积均高于假手术组，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；假手术组小鼠脑组织病理学观察中细胞排列规则，结构完好，细胞核清晰，无病理变化。模型组小鼠脑组织细胞排列较为杂乱，细胞核出现破裂情况，间质水肿，具有明显的炎性细胞浸润情况。模型组小鼠脑组织GCN2、eIF2α、ATF4及NLRP3蛋白表达水平均高于假手术组，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；模型组小鼠脑组织及血清中IL-1β、TNF-α水平均高于假手术组，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：激活GCN2感受器可使下游eIF2α磷酸化，进而激活ATF4信号通路，从而调控NLRP3炎性小体活性水平介导的炎症反应，发挥保护神经组织的作用。
关键词：缺血再灌注损伤; GCN2; elF2a; ATF4; NLRP3；小鼠；
缺血性脑卒中是临床常见的脑血管疾病，具有发病率高、致残率高、死亡率高等特点，该病发病机制极为复杂，多数学者考虑主要与炎症反应、过量氧自由基生成等多种因素有关[1]。GCN2是一种氨基酸感受器，广泛分布于机体各组织及类型细胞中，当细胞内外氨基酸缺乏时，GCN2可通过直接绑定的同源t RNA参与细胞的应激反应[2]。既往研究表明，GCN2为氨基酸饥饿的一个重要传感器，可能在脑内病理生理过程中发挥着重要作用[3]。目前，临床尚无GCN2在脑卒中尤其是获得脑缺血再灌注治疗后对继发性脑损伤保护作用的研究。因此，本研究旨在探讨基于GCN2-el F2α-ATF4-NLRP3信号传导通路对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响，为临床治疗缺血再灌注损伤提供参考依据，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
准备野生型健康空白ICR(CD-1）小鼠36只，体质量25～30 g，年龄8～10周，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。小鼠GCN2单抗、小鼠e IF2α单抗、小鼠ATF4单抗、小鼠NLRP3单抗均购自Abcam公司；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂购自Beyotime生物技术有限公司；小鼠ELISA试剂盒（IL-1β、TNF-α）均购自联科生物技术有限公司。
1.2 方法
(1）建立动物模型。将36只CD-1小鼠随机分为假手术组（不插入线栓）和模型组（制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型），每组各18只。实验前所有小鼠均在同一环境中饲养，标准鼠笼、自由饮食，维持室温23～25℃，相对湿度70%～75%。
(2）模型组脑标本制备。采用0.8%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，将线栓插入小鼠颈总动脉，使其大脑中动脉血供区缺血3 h后，拉出线栓并结扎颈总动脉残端，再灌注24 h。随机抽取6只小鼠，麻醉后开胸，将导管插入主动脉，采用生理盐水快速冲洗灌注，并固定2 h，断头取脑，纵切制成冠状切片，采用10%甲醛溶液及石蜡固定包埋，用于免疫荧光染色分析和HE染色观察小鼠脑组织学变化。另随机选取6只小鼠，再灌注24 h后断头取脑，纵切制成5等份冠状切片，置于2%三苯基氯化四唑溶液中，37℃下水浴20 min，观察脑组织颜色，取左侧脑组织，置于-80℃冰箱内保存备用。
1.3 观察指标
(1)比较两组小鼠神经行为评分，并计算缺血梗死面积。采用神经损伤严重程度评分（NSS）表对小鼠神经行为进行评分，分值0～5分；0分：神经功能正常，5分：死亡。评分越高表示神经损伤程度越严重。取脑组织片染色后拍照，使用Image Pro Plus 6.0软件对图像进行处理，脑梗死体积百分比（%）=矫正梗死体积/左侧脑体积×100%。(2)观察比较两组小鼠脑组织病理学。对各组小鼠进行麻醉处理后，采用断头法处死，取小鼠海马区脑组织，固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常规石蜡包埋及连续切片。HE染色：首先将切片烤干后进行脱蜡处理，之后顺序置入不同浓度的酒精中各复水3 min。使用苏木精染色15 min后清洗3次，使用盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗后使用1%伊红染色，使用酒精进行脱水后进行脱蜡处理，封片后使用显微镜进行观察。(3)比较两组小鼠脑损伤部位GCN2、e IF2α、ATF4及NLRP3蛋白表达。选取模型组小鼠损伤部位脑皮层组织和假手术组小鼠对应部位脑组织，将脑组织置于冰上预冷的玻璃研磨器中，剪碎后加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂（每0.1 g组织加入1 m L RIPA和10μL PMSF），充分研磨裂解脑组织后移入1.5 m L EP管中，离心处理后取上清液并测量浓度，通过Western blot及免疫荧光染色法测定GCN2、e IF2α、ATF4及NLRP3蛋白表达情况。(4)比较两组小鼠脑损伤部位及血清白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。选取模型组小鼠损伤部位脑皮层组织和假手术组小鼠对应部位脑组织，将脑组织置于冰上预冷的玻璃研磨器中，按照体质量体积比1∶9加入等渗盐水充分研磨制成10%脑匀浆，8 000 r/min，离心10 min后取上清液，采用ELISA法及配套试剂盒检测IL-1β、TNF-α表达水平，操作严格按照试剂盒说明进行。
1.4 统计学方法
采用spss 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。相关性分析采用Pearson检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组小鼠神经行为评分及脑损伤面积比较
模型组小鼠神经行为评分、脑损伤面积均高于假手术组，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1 两组小鼠神经行为评分及脑损伤面积比较
注：与假手术组比较，(1)P<0.05。
2.2 两组小鼠脑组织病理学观察比较
假手术组小鼠脑组织病理学观察中细胞排列规则，结构完好，细胞核清晰，无病理变化。模型组小鼠脑组织细胞排列较为杂乱，细胞核出现破裂，间质水肿，具有明显的炎性细胞浸润情况，见图1、图2。
图1 假手术组
图2 模型组
2.3 两组小鼠脑组织GCN2、e IF2α、ATF4及NLRP3蛋白表达比较
模型组小鼠脑组织GCN2、e IF2α、ATF4及NLRP3蛋白表达水平均高于假手术组，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。
表2 两组小鼠脑组织GCN2、e IF2α、ATF4及NLRP3蛋白表达 比较
注：与假手术组比较，(1)P<0.05。
2.4 两组小鼠脑组织及血清中IL-1β、TNF-α水平比较
模型组小鼠脑组织及血清中IL-1β、TNF-α水平均高于假手术组，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05），见表3。
表3 两组小鼠脑组织及血清中IL-1β、TNF-α水平比较
注：与假手术组比较，(1)P<0.05。
3 讨论
脑缺血再灌注是复杂的病理生理变化，不仅会造成脑组织损伤，还会引起全身内分泌调节功能异常，加剧脑组织缺氧、缺血状态[4]。研究表明，脑缺血再灌注损伤后炎性因子迅速活化，可向细胞外释放大量炎症介质，从而加重脑组织损伤[5]。因此，有必要进一步阐明缺血再灌注损伤的致病机制及寻找潜在的治疗靶点。
近年来，临床关于缺血性脑卒中炎症反应的研究已广泛开展，GCN2作为一种氨基酸感受器，在脑缺血再灌注发生后对继发性脑损伤具有多种保护作用：(1)GCN2是氨基酸饥饿的感受分子，可通过自我磷酸化和磷酸化真核起始因子-2α（e IF2α）参与细胞的应激反应，从而影响细胞蛋白质合成。(2)GCN2可调控氨基酸饥饿信号通路，通过感知在组织损伤和修复过程中发生的氨基酸耗竭，响应炎症过程中的细胞死亡，在限制炎症反应的负反馈机制中介导脑保护作用。(3)e IF2α磷酸化后在蛋白质翻译起始过程中发挥着重要调节作用，激活GCN2可以实现自我磷酸化和e IF2α磷酸化，从而降低整体蛋白水平，减少应激状态下细胞承受的压力。(4)e IF2α同时特异性激活转录因子-4(ATF-4）等多种蛋白翻译，从而调控NLRP3炎性小体的活性水平，加快IL-1β、Caspase-1等炎性因子成熟和分泌，抑制NLRPS炎性小体过度活化而减轻炎症反应的病理生理过程[6]。
本研究结果显示，通过对比假手术组小鼠和模型组小鼠神经功能改变情况和脑损伤面积，模型组小鼠神经行为评分、脑损伤面积均高于假手术组，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05），与肖莉等[7]学者研究结果相似。提示脑缺血局部组织再灌注时会出现脑损伤，且伴有严重的脑机能障碍。另外，本研究结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠脑组织GCN2、e IF2α、ATF4及NLRP3蛋白表达水平及炎性因子水平均明显升高（P<0.05）。我们认为，在缺血再灌注模型中，GCN2可能通过调控脑缺血再灌注后NLRP3炎性小体的活性水平，进而促进小鼠脑损伤的发生进展，其作用机制可能通过增加细胞因子的释放和促进神经元凋亡来实现。
综上所述，激活GCN2感受器可使下游e IF2α磷酸化，进而激活ATF4信号通路，从而调控NLRP3炎性小体活性水平介导的炎症反应，发挥保护神经组织的作用。
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