邓凤春1杨 钰2赵红晔3王 滨3周 丽3沈云虹3
1.齐齐哈尔医学院解剖教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院第三附属医院医务科，黑龙江齐齐哈尔 161006；
3.齐齐哈尔医学院生理教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006
[摘要] 目的 探讨隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法 通过体外无菌传代培养2013年5月所购的人胃癌SGC-7901细胞，设空白对照组与20 μm、40 μm、60 μm、80 μm和100 μm五个浓度的隐丹参酮组，分别于6 h、12 h、24 h和48 h后采用MTT法检测隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率，并观察药物作用24 h和48 h后细胞的形态变化。 结果 ①刺激6 h和12 h后，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率均＜35%；刺激24 h后，随着隐丹参酮浓度的递增，其对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率从33%逐渐增加至72%；刺激48 h后，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率均＞50%。②刺激24 h后，隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的IC50为59.11 μM，③与空白对照组相比，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞均有抑制作用（P＜0.01），且除了20 μM与40 μM组及40 μM与60 μM组之间差异无统计学意义（P分别为0.162和0.110），其余各组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的增殖有明显的抑制作用，且有时间和剂量依赖关系；究其原因可能是隐丹参酮能够诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡，具体机制有待进一步研究。
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关键词 隐丹参酮；人胃癌SGC-7901细胞；MTT；细胞凋亡
[中图分类号] R735.2[文献标识码] A[文章编号] 1674-074２（２０１4）12（b）－０049-02
[基金项目] 黑龙江省中医药管理局中医药科研项目（ZHY12-Z183）。
[作者简介] 邓凤春（1975-），男，吉林农安人，硕士，讲师，主要从事中药抗肿瘤作用及其机制的研究。
胃癌（Gastric Cancer）是常见的消化道恶性肿瘤，严重危害威胁人类健康[1-3]，因此对胃癌的防治和治疗等研究成为肿瘤研究领域的一大热点课题。传统中药以其价格低廉、毒副作用小的优势，辅助治疗胃癌有很好的前景。隐丹参酮（cryptotanshinone）是从活血化瘀中药丹参中提取出的脂溶性有效成分，具有抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡或分化的作用[4]，但有关隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞作用的研究，国内却鲜有报道。该研究采用MTT法检测隐丹参酮对SGC-7901细胞（2013年5月购自上海生命科学研究院细胞资源中心）增殖的抑制作用，以期进一步丰富隐丹参酮抗肿瘤作用的基础研究、拓宽隐丹参酮的应用范围，为胃癌患者的辅助治疗提供一种新的思路。现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
1.1.1肿瘤细胞人胃癌SGC-7901细胞于2013年5月购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.1.2药品及试剂隐丹参酮购自上海源叶生物科技有限公司（HPLC≥98%）；胎牛血清（FBS） 购自杭州四季青生物工程材料研究所；RPMI 1640培养基及细胞消化液胰酶（Tyrisin）为美国Gibco公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均为美国Sigma公司产品。
1.1.3主要仪器细胞培养瓶产自美国Corning公司；细胞培养板及针头滤器（孔径：0.2 um）产自美国Costar公司；MR1812高速冷冻离心机产自法国Jouan公司；101-1AB型电热鼓风干燥箱产自天津市泰新特仪器有限公司；UV-2550 UV-visible speetrophoto meter，SHIMADZU Corporation Assembled in China；倒置显微镜（IMT-2）产自Olympus公司；超净工作台产自苏州安泰空气技术有限公司；5%CO2孵箱产自Thermo Electron Corporation。
1.2方法
1.2.1药液配制隐丹参酮用DMSO配成一定浓度的储备液，过滤除菌，分装冻存，临用再前用培养液稀释成所需浓度（药物作用于细胞时，DMSO的终浓度小于或等于0.1% （v/v），该浓度对细胞生长无影响）。
1.2.2隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞存活率的影响采用MTT法比色法：取96孔培养板，边缘的孔内加PBS缓冲液填充，中间的孔作为实验观察孔。除调零孔不加细胞悬液外，其它各实验观察孔，调整细胞悬液浓度，取无菌传代培养第3~8代细胞，以1×104/孔的密度接种于孔板内，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞稳定生长4 h后，设空白对照组和五个不同浓度的隐丹参酮组（终浓度设梯度为20、40、60、80、100 μM），每种浓度5个复孔。除空白对照组外，每孔中加入相应浓度的隐丹参酮，分别刺激6 h、12 h、24 h、48 h后，加入0.5%MTT溶液，继续培养4 h；小心吸去培养液；每孔加入150 μl DMSO，置37 ℃、5% CO2 细胞培养箱培养10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570 nm/630 nm测量各孔的吸光值。重复测定3次后，分别计算抑制率。抑制率=（对照组OD值-用药组OD值）/对照组OD值×100%。（注：每组去掉一个OD值最低值和一个最高值，取剩余三个复孔OD值来计算。）
1.2.3细胞的形态学观察取对数生长的细胞，以5.0×105/孔的密度接种于6孔细胞培养板，设空白对照组和五个不同浓度的隐丹参酮组。待细胞密度长至70%~80%时，除空白对照组外，每孔中加入相应浓度的隐丹参酮，均于作用24 h和48 h后倒置显微镜下观察各组细胞形态变化。
1.3统计方法
所得数据用均数±标准差（x±s）表示，采用spss 13.0统计分析软件的One-Way ANOVA过程进行方差分析，最小显著差法（Least significant difference，LSD）进行两两比较，双侧检验以P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1不同浓度的隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞存活率的影响
采用MTT比色法检测不同浓度的隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞存活率的影响，结果如表1所示。
结果显示，隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞刺激6 h和12 h后，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用并不明显，抑制率均低于35%；刺激24 h后，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用较明显，抑制率介于33%~72%之间；刺激48 h后，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用明显，但最低浓度的隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率已超过50%。故选取24 h作为隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞抑制作用的最佳时间。
刺激24 h后，隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用与药物浓度之间呈线性关系（y=0.498x+ 20.56，R2= 0.972），并由此计算出隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的半抑制浓度（IC50）为59.11 μM，如图1所示；与空白对照组相比，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞均有抑制作用（P＜0.01）；各隐丹参酮组间两两比较结果为：隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率，在20 μM与40 μM组之间和40 μM与60 μM组之间差异无统计学意义（P分别为0.162和0.110），其余各组间差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.2不同浓度的隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响
在倒置显微镜下，人胃癌SGC-7901细胞形态如下：空白对照组的SGC-7901细胞呈现梭形，大小均一，细胞壁光滑，折光性好。不同浓度隐丹参酮作用SGC-7901细胞24 h后出现的变化：药物浓度低时，核染色质固缩、聚集在核膜周边；随着药物浓度加大，大部分细胞的细胞膜出现皱缩、内陷和芽状突起。48 h 后出现的变化：药物浓度低时，核染色质固缩、聚集在核膜周边；药物浓度适中时，大部分细胞出现凋亡，胞浆浓缩、胞膜起泡，出芽，细胞体积逐渐变小，出现凋亡小体；药物浓度高时，细胞出现坏死现象，细胞膜破裂，内容物释放。
3讨论
目前，从丹参中已提取近50种丹参酮及其衍生物[5]，隐丹参酮是众多丹参酮中的一种，具有改善微循环、清除氧自由基、抗感染等药理作用，近年来它的抗肿瘤活性陆续被报道[6]。
研究发现隐丹参酮对前列腺癌、胆管癌、黑色素瘤等多种人类肿瘤细胞具有不良反应，引起了广泛关注[7-9]，但有关隐丹参酮对胃癌的影响少见报道。
该研究通过MTT法检测不同浓度的隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，结果显示：①刺激6 h和12 h后，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率均＜35%；刺激24 h后，随着隐丹参酮浓度的递增，其对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率从33%逐渐增加至72%；刺激48 h后，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率均＞50%。表明隐丹参酮具有抑制人胃癌细胞SGC-7901增殖的作用，抑制作用的最佳时间为24 h。②刺激24 h后，隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的IC50为59.11 μM，明显低于陈春雷等[10]报道的隐丹参酮对人胆管癌HCCC-9810细胞作用24 h的IC50（93.77μM），表明隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用更为显著。③与空白对照组相比，各隐丹参酮组对人胃癌SGC-7901细胞均有抑制作用（P＜0.01），且除了20 μM与40 μM组及40 μM与60 μM组之间无差异无统计学意义（P分别为0.162和0.110）之外，其余各组间差异有统计学意义（P＜0.05），表明隐丹参酮对人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用呈现一定的浓度依赖性。
不同浓度隐丹参酮作用人胃癌SGC-7901细胞，细胞呈现不同的形态特征，浓度很低时，胞质均匀，DNA逐渐变成不规则状，核质固缩聚集，有出泡现象。随着浓度增加，细胞出现明显的核固缩，染色质片段化和边缘化，形成凋亡小体；最后细胞呈坏死状，细胞变圆，裂解，漂浮于培养液中。实验结果表明，隐丹参酮能够诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡，且细胞凋亡在一定范围内跟药物浓度呈依赖性关系。
今后，该研究将从细胞、分子及基因水平探索隐丹参酮抗肿瘤作用机理，以期进一步丰富隐丹参酮抗肿瘤作用的基础研究、拓宽隐丹参酮的应用范围，为其在肿瘤治疗领域的临床应用积累试验和理论依据。
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参考文献
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（收稿日期：2014-09-11）