林子英 任妮娜 刘刚
【摘要】目的 构建果蝇神经粘附分子Neuroligin4诱饵蛋白载体。方法根据Neuroligin4基因的特点，分别设计胞外段和胞内段的引物序列，通过PCR、酶切等手段将目的片段接入诱饵载体中。结果
经酶切和测序鉴定，成功构建Neuroligin4胞外端和胞内端诱饵蛋白质粒。结论Neuroligin4诱饵载体的成功构建为研究Neuroligin4基因的功能奠定了基础。
【关键词】Neuroligin4 神经粘附分子 诱饵载体
【Abstract】Objective
To construct the bait protien of drosophila neural adhesion molecule Neuroligin4. Methods
Respectively according to the characteristics of the Neuroligin4 genes， we designed primer sequences of extracellular and intracellular， and connected purpose fragment with bait plasmid by PCR and enzyme digestion， etc. Results
With identification by the enzyme digestion and sequencing appraisal array， the Neuroligin4 extracellular and intracellular bait plasmids were successfully contructed. ConclusionNeuroligin4 bait carrier successfully building has paved the way for the function research of Neuroligin4 gene.
【Key words】 Neuroligin 4， Neural adhesion molecule， Bait carrier
【Author′s address】Guangdong Medical College， Zhanjiang， Guangdong， 524023， China
doi：10.3969/j.issn.1671-332X.2014.12.005
起初的研究发现，孤独症存在染色体异常，继而通过连锁分析法更加深入探讨了相关基因的作用。迄今为止，已明确的伴有孤独症表型的单基因遗传病有Angelman综合症、Tett综合症、脆性X综合症、结节性硬化症等。对于孤独症神经生物学的研究，集中在突触可塑性上，认为树突的发育异常可能导致孤独症的发生。研究发现编码核心的跨突触成分Neurexin/Neuroligin/PSD-95/ SAPAP/ Shank的基因都是孤独症的易感基因。 Neuroligin作为Neurexin的配体，在突触的发育形成，功能维持起着极其重要的作用。Neuroligin家族蛋白大多数在神经系统表达，而且在人类、哺乳动物、小鼠、线虫、果蝇等系统中都有不同的同源基因。Neuroligins是典型的单跨膜蛋白，它们包含4个不同的结构域：位于N端的可被切除的信号肽、一个乙酰胆碱酯酶类似结构域（但是没有催化活性）、一个高度保守的单跨膜结构域和一个短的细胞内序列PDZ结合基序（具有高度保守的C末端序列）。通过生物信息分析发现，果蝇中存在着四个编码Neuroligin分子的基因，分别命名为DNlg1，DNlg2，DNlg3和DNlg4。他们与人类Neuroligin1的同源性分别是19.3%，22.4%，25.9%，22.2% ［1］。其中，DNlg1和DNlg2都有相应的报道，它们对突触形成，突触后分化有着重要的影响 ［2-4］。近期果蝇Neuroligin4（CG34139）基因研究尚无报导，它如何调控其上下游蛋白以及在神经突触发生的机制尚有待进一步研究和阐明。本研究以Neuroligin4的胞外端和胞内端片段作为诱饵蛋白体系，试图利用这个体系通过酵母双杂交技术［5］ 从果蝇cDNA文库中筛选与Neuroligin4相互作用的蛋白，对于进一步阐明DNlg4在体内的生理功能具有重大意义。
1材料与方法
1.1材料
果蝇Neuroligin4 cDNA模板、pGBKT-7、pGBT-9、大肠杆菌DH5a由本实验室保存。LB培养基，氨苄抗生素，卡那抗生素由上海生工生物公司购买。各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs等由TaKaRa公司购买。引物及克隆测序均由英潍捷基公司提供，其他试剂均为国产分析纯。
1.2仪器
PCR仪5531，高速离心机（Eppendorf公司）；凝胶成像分析仪GDS800（UVP公司）；生物培养箱Thermofisher144L（Thermo公司）等。
1.3方法
1.3.1PCR扩增目的片段参考Flybase登录的Neuroligin4 基因的cDNA序列分别设计N端和C端片段引物，N端上游引物序列为：5′-AACGAATTCATGGGGGAAAGTCAGCTGCT-3′（下划线为EcoR I酶切位点），下游引物为5′- ATCCTGCAGGCAGGGCCGTCGAATAGGCCG- 3′（下划线为Pst I酶切位点）；C末端上游引物为- AACGAATTCCAGCGCGACAAGACGCGGCT -3′（下划线为EcoR I酶切位点），下游引物为5′- ATCGTCGACGGACGCGCATCTCGTCCATCG-3′（下划线为Sal I酶切位点）。PCR反应体系50 μl：高保真DNA Taq酶0.5 μl，cDNA 1 μl。扩增条件：58 ℃退火30 s，72 ℃延伸，每个循环延伸30 s，30个循环反应。最后琼脂糖电泳，胶回收目的条带。
1.3.2目的片段与诱饵载体的酶切与连接将扩增产物与诱饵载体pGBKT-7分别用EcoR I和Pst I酶切，得到的酶切产物进行琼脂糖电泳后回收。得到的酶切产物进行连接，体系20 μl：DDW 11.5 μl，10XLigase Buffer 2 μl，载体 3 μl，目的片段 3 μl，T4连接酶6 μl。16 ℃过夜连接。
1.3.3转化和克隆鉴定得到的连接产物转化至DH5a感受态中，过夜培养12 h后，挑取单克隆筛选重组质粒，双酶切进一步验证。验证后的质粒送至测序。
2结果
果蝇Dneuroligin4基因位于果蝇3号染色体的右臂92D5-8，由17个外显子，12个内含子组成。基因全长40 665 bp，其中CDS为3 843 bp，可以编码1 281个氨基酸，预计表达蛋白分子经糖基化等修饰后大小约为140 kD。它的蛋白包括一个长的胞外端，其中含有一个较大的类乙酰胆碱酯酶结构域，因其决定酯酶活性的关键位点的丝氨酸转变成了甘氨酸，因此，这个结构域不具备酯酶活性。在跨膜区的胞外端是一段含有多个糖基化位点的区域，在跨膜区的胞内端是一段特异性较高的无规卷曲区域，如图1A。在C末端是一个保守的ELRV序列，是典型的PDZ结合基序。
鉴于DNlg4的定位和分布，可以确定DNlg4是一个神经相关蛋白，又由于DNlg4是一个I型跨膜蛋白，因此整个蛋白不适合用于酵母双杂交系统。但是因为胞外端和胞内端的结构和功能迥异，可以将其分为胞外端和胞内端两个部分分别来研究。所以我们将DNlg4蛋白分为两部分当做诱饵蛋白去筛库，既能清晰的确定蛋白相互作用的Domain，又能推断DNlg4各部分功能，最终实现整个蛋白功能的推断，如图1A。
DNlg4胞外端所设计的引物位于起始密码子到2 472 bp处，引入EcoR I和Pst I酶切位点，首先用PCR方法从全长cDNA中扩增目的片段，并将其接入pGBKT7诱饵载体中，转化得到克隆，经EcoR I和Pst I双酶切鉴定，条带约为2 500 bp，与目的片段大小一致，如图1B。
DNlg4胞内端所设计的引物位于2 542 bp到终止密码子处，引入EcoR I和Sal I酶切位点，首先用PCR方法从全长cDNA中扩增目的片段，并将其接入pGBT9诱饵载体中，转化得到克隆，经EcoR I和Sal I双酶切鉴定，条带约为1 300 bp，与预计大小一致，如图1C。
3讨论
2011年10月KNIGHT D等［1］对果蝇中Neuroligin和NRX作了相关的报道，对DNl1和DNl2的表型和功能作了相应的比较。2010年DANIEL等［1］揭示果蝇Neuroligin1能够在谷氨型NMJ中促进生长和突触后分化的作用。他指出，DNl1的null突变表型引起NMJ中突触Bouton数量的大幅度减少，以及神经递质的释放量也明显下降。当DNl1缺失的情况下，突触后分化明显出现障碍。而当Dnl1胞内结构域缺失（即DNl1-GFP△cyto）的情况下，呈现出明显的显性负效应现象。这是因为DNl1-GFP△cyto仍然保留了胞外端部分，使得DNl1仍然能够形成复合体，但是本身已经失去功能。尽管胞外端能够与NRX相互作用起到很重要的作用，但是胞内端的作用似乎对DNl1的功能及对突触前Bouton是必需的。这是由于胞内端部分能够与突触后膜下骨架蛋白相互作用，这个结论已经在哺乳动物中已被证实。比如NL2就能在抑制型突触GABAergic与PSD蛋白Gephyrin和Collybistin相互作用。接着，2011年SUN等［2］发表了关于DNl2的报道。DNl2缺失突变体呈现出NMJ表型的许多结构性缺陷，表现为轴突管分支的减少和突触Bouton数量的减少，但是神经递质的释放量增加，每个Bouton中AZs数量的增加但是SSR厚度变小。还表现出突触后谷氨酸受体数量的减少，以及谷氨酸受体组分发生改变。Null突变体的这些表型能够被突触后Dnl2的表达所挽救。他还证明了DNl2确实能够与突触前的Nrx相互作用。当DNl2和DNRX双突变的情况下出现蛹期致死或突
图1酶切鉴定结果
A： Dneuroligin4（DNlg4）基因组结构特点以及DNlg4的胞外端ECD和胞内端ICD的选取片段；
B： 酶切检测pGBKT7-DNlg4-ECD重组质粒；
C： 酶切检测pGBT9-DNlg4-ICD重组质粒。
触发育障碍等表型。这些实验证据表明，DNl2是突触后成熟和功能所必须的分子。目前，国内外对Neuroligin4的基因功能做了大量的研究，但是对Neuroligin4真正功能的探索的报道相对比较贫乏。
综上所述，本研究根据Neuroligin基因结构的特点，分别截取胞外段和胞内段，去掉跨膜结构，设计引物，将这两段序列通过PCR、酶切的方式接到诱饵载体上，测序结果显示所得的两个克隆与目的序列比对成功，表明我们成功获得了Neuroligin基因的两个诱饵蛋白质粒，为后续研究Neuroligin基因的功能提供了良好的基础。
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［5］WALLACH D， BOLDIN M P，KOVALENKO A V，et al. The yeast two-hybrid screening technique and its use in the study of protein-protein interactions in apoptosis［J］. Current Opinion in Immunology， 1998，10（2）：131-136.