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从固定液保存的刺参样品中提取基因组DNA的改进方法

  • 投稿Sun1
  • 更新时间2015-09-15
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王祖哲,王利,顾晨雷,马普,王秀利1*

(大连海洋大学水产与生命学院,辽宁 大连116023)

刺参(Apostichopus japonicus)分类学上隶属于棘皮动物门、游走亚门、海参纲、楯手目、刺参科,是重要的经济海参物种[1]。刺参含有丰富的蛋白质、酸性黏多糖、维生素、氨基酸、海参皂苷以及多种微量元素和生理活性物质,具有很高的营养、保健和药用价值。其中以产于我国辽宁、山东沿海的刺参营养、药用价值最高。随着人们生活水平的提高,刺参市场需求量显著增加。20世纪80年代以来,随着海洋经济快速发展,我国刺参增养殖随之迅猛发展,已经形成了产业化。据不完全统计,我国刺参产量产值每三至五年翻一番。目前,刺参的年产量已接近20万吨,产值达到300亿元以上,刺参已经成为我国水产业单种产值最高的经济物种之一。

随着刺参养殖产业的发展,必须加强刺参生物学特性、遗传多样性、功能基因的开发与利用等等方面的研究,才能科学开展刺参新品种的培育与健康养殖。在科研工作中,以PCR技术为核心的分子标记技术如限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星(SSR)、单核苷酸多态性(SNPs)等遗传信息的分析在水产动物遗传育种、遗传多样性研究等方面已经得到广泛应用。为获得高质量的刺参基因组DNA,冯志纲等(2008)和孙孝德等(2010)进行了刺参基因组DNA提取方法的探讨,但他们都是采用活体刺参即时采样,即时提取[2-3]。而在实际科研工作中,科研工作者往往需要到刺参养殖场进行采样,通过将刺参样品保存在70%的乙醇固定液中带回实验室。常规的酚-氯仿抽提法虽然适用于各种动物组织DNA的提取,简单易行,一般实验室即可操作,但由于刺参含有丰富的黏多糖和蛋白质[4],所以该方法应用于刺参DNA提取时效果并不理想。本研究优化与改进了酚-氯仿抽提法对适应70%乙醇固定保存的刺参组织样品中基因组DNA的提取,为获得高质量刺参基因组DNA提供方法保障。

1材料及方法

1.1样品采集

实验所用刺参取自大连某养殖场,用70%乙醇[5]固定刺参体壁后带回实验室于-20 ℃保存备用。

1.2常规的酚-氯仿抽提法提取刺参基因组DNA

常规酚-氯仿抽提法见教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献[6]。

1.2.1样品处理取保存在70%乙醇中的刺参体壁样品约0.2~0.4 g,用滤纸将酒精尽可能地吸干,放入灭菌的1.5 mL离心管,用剪刀剪碎。

1.2.2水浴向1.5 mL离心管中加入600 μL DNA提取液(10 mmol/L Tris-Cl,0.1 mol/L EDTA,0.5% SDS)和蛋白酶K(20 mg/mL)至终浓度100 μg/mL后充分混匀,放入恒温55 ℃水浴锅中消化,水浴时每隔15 min翻转一次,直到消化完全。

1.2.3萃取将溶液冷却至室温,①加入等体积的用0.1 mol/L Tris-Cl(pH 8.0)平衡过的苯酚。将离心管置于旋转器上,使离心管缓慢颠转10 min以温和地混合两相。12 000 r/min,离心15 min,分离两相。②取上清,加入苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液轻柔混匀10 min,以12 000 r/min,离心10 min。③取上清,加入等体积氯仿轻柔混匀10 min,以12 000 r/min,离心10 min。

1.2.4沉淀DNA在取出的上清液中加入2倍体积的-20 ℃预冷的无水乙醇,充分混匀后放在-20℃冰箱中2 h,然后以12 000 r/min,离心15 min,弃上清。

1.2.5洗盐加入70%乙醇500 μL洗涤,12 000 r/min,离心5 min,弃上清后重新6 000 r/min离心5 min。取出离心管倒置在滤纸上数分钟,吸干剩余液体。

1.2.6溶解DNA加入200 μL 1×TE以及2 μL RNA酶轻弹混匀后,放置于4 ℃过夜备用。

1.2.7检测制备1%的琼脂糖凝胶,用EB显色,3 μL的DNA模板与3 μL的6×Loading buffer混匀上样,120 V电泳20 min,电泳结果经凝胶成像显示DNA的质量,用微量核酸蛋白检测仪(NV3000)测定DNA的纯度与浓度。

1.3改进的刺参基因组DNA提取方法

将1.2.2中裂解液EDTA的浓度提高了10倍,为1 mol/L。

将1.2.3中①加入等体积Tris-平衡酚调整为酚/仿6:1(v/v)。将1.2.3中②、③步中苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿混匀时间缩短为5 min。将1?2.3萃取后增加3次氯仿抽提次数。

1.4DNA提取试剂盒

应用天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒,按照说明书的方法对70%乙醇保存的刺参样品进行基因组DNA提取。

1.5PCR扩增

1.5.1微卫星位点选择选取刺参微卫星序列(GenBank No.EF032102),设计引物,扩增的目的片段大小为237bp。 上游引物序列:5′–TCCGACTTTTAGGACCAGAT–3′;下游引物序列:5′–TGGGTTTTCACCTCAGACG–3′。

1.5.2PCR反应体系25 μL体系,包括10×PCR buffer(Mg2+ Plus)2.5 μL,dNTP 2μL;上、下游引物(10 M)各2 μL,DNA模板1 μL,TaqE(5 U/μL)0.5 μL;ddH2O 15 μL。

1.5.3PCR扩增程序94 ℃预变性5 min;进行如下26个循环:94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;72 ℃延伸7 min。

2结果与讨论

本研究采用常规的酚-氯仿抽提法、改进方法和公司试剂盒的三种方法对70%乙醇保存的刺参体壁组织样品进行基因组DNA的提取,DNA提取结果见图1。由图1可见,常规的酚-氯仿法和试剂盒提取的DNA,从琼脂糖凝胶电泳图可以看出提取的基因组DNA有降解、凝胶孔中存在大分子杂质。而改进的酚-氯仿法提取的DNA,从琼脂糖凝胶电泳图可以看出提取的基因组DNA条带清晰、整齐,说明提取的基因组DNA分子较完整、无杂质、基本没有降解。经微量核酸蛋白检测仪测得常规的酚-氯仿法和试剂盒提取的基因组DNA在260 nm和280 nm的光密度值的比值(A260/A280)分别为1.26和1?49,远远小于1.8,说明DNA中有蛋白等杂质的存在;而改进的酚-氯仿法法提取的基因组DNA的A260/A280为1.89,在理想值范围。常规的酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度为404 μg/mL,试剂盒法提取的DNA浓度为319 μg/mL,改进的酚-氯仿法法提取的基因组DNA的浓度为389 μg/mL。

(a常规的酚-氯仿方法、b为试剂盒方法、c改进的酚-氯仿方法)

图2为以上述三种方法分别提取的基因组DNA为模板,以刺参SSR的一对引物所进行的PCR扩增,从图2的A、B中可以看出,用常规的酚-氯仿法和试剂盒提取的DNA做模板得到的PCR产物有杂带,不能用于诸如目的基因片段的连接等实验。而用改进的酚-氯仿法提取的DNA做模板得到的PCR产物条带单一清晰,可用于后续实验。

分子标记技术是建立在PCR基础之上的,而模版DNA的质量又是影响PCR扩增的关键因素。因此如何得到更高质量的刺参基因组DNA至关重要。尽管有以活体取管足等组织提取刺参基因组DNA,但对于保存在70%乙醇中的刺参样品提取高质量DNA的报道文献不多。经过多次反复应用常规的酚-氯仿法和试剂盒进行刺参基因组DNA的提取,提取的效果很不理想,这主要是由于刺参体内黏多糖和蛋白质含量相当丰富。本文针对刺参的生物学特点,在对刺参组织样品进行消化时,将裂解液中EDTA的浓度提高了10倍。因为EDTA具有拆解蛋白质的能力,这就分担了后面酚仿萃取时的压力。同时,针对刺参DNA提取过程中极易降解的特点,我们改变了酚仿抽提时间和次数。本实验的结果表明:以改进的酚-氯仿法提取的刺参基因组DNA,其A260/A280比值理想;从SSR-PCR扩增结果来看,以改进的酚-氯仿法提取的刺参基因组DNA为模版扩增的PCR产物效果更好。

教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献:

[1] 王颖,仇雪梅,王娟,王秀利.刺参病害现状及其生物技术检测的研究进展[J].生物技术通报,2009 (11): 60-64

[2] 冯志纲,于佳平,丁君,等.仿刺参基因组 DNA 提取方法改进[J].生物技术通报 (S1): 2008年增刊:352-355

[3] 孙孝德,孙国华,杨建敏,等.刺参基因组 DNA 提取的探讨[J].生物技术通报,2010(3):149-153

[4] 苏秀榕,娄永江,常亚青,等.海参的营养成分及海参多糖的抗肿瘤活性的研究[J].营养学报,2003,25(2): 181-182

[5] 刘保忠, 宋林生,相建海.海湾扇贝样品不同保存条件下 DNA 的提取及 RAPD 扩增比较[J].海洋科学,2001, 25(3): 51-53

[6] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning [M]. New York: Cold spring harbor laboratory press, 1989

(收稿日期:2014-05-05;修回日期:2014-05-08)