梁传红 LIANG Chuan-hong；陈帅 CHEN Shuai；李开雄 LI Kai-xiong；许程剑 XU Cheng-jian
（石河子大学食品学院，石河子 832000）
摘要：为了提高赤霞珠葡萄籽的有效利用率，本文采乙醇浸提法提取葡萄籽中的多酚，并通过响应面法优化提取条件。在单因素实验的基础上，依据Central Composite 中心组合设计原理，采用Design-Expert.8.05数据分析软件，对多酚的提取进行了四因素三水平的优化分析。确立最佳提取条件：乙醇体积分数59.39%，提取时间2h，提取温度82.90℃，料水比21.03，在此条件下蛋白质的提取理论值达到35.6603 mg/g。
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关键词 ： 响应面法；乙醇浸提；葡萄籽多酚
中图分类号：TQ914 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2015）23-0179-03
作者简介：梁传红（1989-），女，新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，研究方向为食品加工与安全；许程剑（通讯作者）（1978-），男，安徽庐江人，副教授，工学博士，研究方向为天然产物制备与功能活性研究。
0 引言
葡萄是世界普遍栽培的水果之一,大部分的葡萄用于酿酒，近几十年来我国的葡萄酒行业发展迅猛，在葡萄酒的加工过程中，有约20%-30%的葡萄皮渣、籽等下脚料，大部分酒厂会直接扔掉或廉价卖给农民做饲料及燃料。这样做不仅造成了环境污染，而且也是资源的浪费。而从中提取出有效物质并进行加工利用，既可以降低生产成本，又可以提高资源的利用率[1，2]。随着对葡萄皮籽中化学成分的深入研究，发现葡萄皮籽中有丰富的营养物质，如油脂、蛋白、多酚类等。目前，对葡萄籽的开发利用引起的国内外广泛的关注，主要集中在葡萄籽油、抗氧化物质的提取与利用，而对葡萄籽多酚类物质的提取利用较少。红葡萄籽中多酚含量可达50%-70%，这类多酚物质由儿茶酸等酚酸类，黄烷酮类、花色苷类、黄酮醇类等物质组成，其中以原花色苷类物质最为丰富。多酚类化合物具有很强的抗氧化活性，在体内抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍，VC的20倍，其制品主要以药品、保健品、化妆品为主。葡萄籽多酚还具有抗肿瘤、预防神经退行性改变、抗炎、抑制微生物、抗疲劳等作用[3]。为合理利用这一资源，本文对新疆石河子本地的葡萄品种赤霞珠葡萄籽蛋白质的提取进行了研究。
1 材料与方法
1.1 主要材料和仪器 主要实验材料如下：赤霞珠葡萄籽，新疆石河子市；无水乙醇、没食子酸、无水碳酸钠、钨酸钠、泪酸钠、磷酸、硫酸锂、盐酸等，均为国产分析纯。主要实验仪器如下：FW80型粉碎机，温岭市百乐粉碎设备厂；BS224S型分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；GRX20型干热消毒箱，上海精宏实验设备有限公司；SH21-1型磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；Neofugel15R型高速冷冻离心机，香港力康；FDU-1200型真空冷冻干燥机，日本SHIMADZU；其他为实验室常规仪器。
1.2 实验方法
1.2.1 没食子酸标准曲线的绘制 精确称取没食子酸0.500g，100mL容量瓶定容，在6 只100mL容量瓶中分别加入5.0g/L没食子酸标准样品0、1、2、3、5、10mL，加蒸馏水定容至100mL，分别配制成浓度为0、50、100、150、250、500mg/L的试液。取6支容量瓶，分别吸取上述溶1mL，各加蒸馏水10mL、现配福林-肖卡试剂[4]5mL，在30s至8min内各加入10mL10%碳酸钠溶液，混合后100mL容量瓶定容。上述溶液在20℃下放置2h，然后在765nm测定吸光度值，绘制标准曲线。
1.2.2 赤霞珠葡萄籽的脱脂处理 将葡萄籽通过粉碎机粉碎，过40目筛。称取40g葡萄籽粉于250mL烧杯中，按1:5的料液比加入石油醚放在磁力搅拌器上搅拌6h后，静置5-6min使固液分离，倒出上清液回收利用。然后向固相中按1:10的料液比重新倒入石油醚，磁力搅拌6h，倒出上清液回收利用，固相葡萄籽粉用蒸馏水清洗后晒干收集备用。
1.2.3 葡萄籽多酚的提取 赤霞珠葡萄籽脱脂粉碎物→加入乙醇溶液→恒温水浴→离心（8000r/min，10min）→取上清液→浓缩→冷冻干燥→葡萄籽多酚
1.2.4 单因素实验 选择影响多酚得率的因素：乙醇体积分数（50、60、70、80、90%）、浸提温度（50、60、70、80、90℃）、浸提时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h）、液料比（10、15、20、25、30）进行单因素实验，分别考察各个单因素对葡萄籽蛋白质提取的影响。
1.2.5 响应面优化实验 在单因素的基础上，选取对葡萄籽蛋白质提取效果影响较大的四个因素，采用响应面分析软件Design-Expert.8.05建立四因素三水平的Central Composite模型，通过实验确立最佳提取工艺参数。变量因素编码表及水平见表1。
1.2.6 数据分析 实验进行三次平行试验，数据值为平均值±标准偏差（SD）。数据分析采用Origin 8.0以及Design-Expert.8.05软件。
2 结果与讨论
2.1 没食子酸标准曲线
如图1所示，没食子酸浓度在一定范围内与吸光值呈线性相关，线性回归方程为y＝1.1984x+0.0190，相关系数R2＝0.9968，标准曲线准确度较高，证实可用。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 提取温度对提取量的影响 在60%乙醇、液料比20、提取时间2h、不同提取温度的条件下，葡萄籽多酚提取量随浸提温度的升高呈现先上升后下降的趋势，当温度达到80℃时提取量最大。可能是由于温度升高有利于多酚物质的运动，在不断震动下溶出，当温度上升到一定后，多酚物质易被氧化，从而影响多酚物质检出量[5]。
2.2.2 提取时间对提取量的影响 在提取温度80℃、60%乙醇、液料比20、不同提取时间的条件下，葡萄籽多酚提取量随浸提时间的升高呈现逐渐升高的趋势，并趋于一定范围。可见提取时间对多酚影响比较小，根据市场经济效益和尽可能多的提取多酚含量，提取时间2h较为合适。
2.2.3 乙醇体积分数对提取量的影响 在提取温度80℃、提取时间2h、液料比20、不同乙醇体积分数的条件下，葡萄籽多酚提取量随乙醇分数的升高呈现先上升后下降的趋势，当乙醇体积分数为60%时提取量最大。这可能与多酚类物质在植物中多以结合状态存在有关[6]，纯有机溶剂不足以破坏多酚类物质与蛋白质等的连接，使提取率降低。
2.2.4 液料比对提取率的影响 在提取温度80℃、60%乙醇、提取时间2h、不同液料比的条件下葡萄籽多酚提取量随物料比的升高呈现先上升后趋于平衡的趋势，当液料比为20时提取量最大。
2.3 响应面优化分析
根据响应面分析法试验结果，对试验数据进行多元回归拟合分析[7，8]，得到葡萄籽多酚提取量与各因素变量的二次方程模型：
多酚提取量=+33.6+4.04×A+0.84×B-1.08×C+0.76×D+ 0.37×A×B-0.29×A×C-0.55×A×D+0.86×B×C-0.050×B×D- 0.27×C×D-7.44×A2+0.44×B2-2.90×C2-1.38×D2
回归方程的相关系数R2=0.9871，说明该方程与实际情况拟合良好，可以用该方程代替真实实验进行分析。表5给出了由响应面分析法对上述数学模型进行方差分析 的结果。该二次回归方程的模型项、单项A、B、C、D、二次项A2、C2、D2表现出差异极显著，BC 表现出差异显著。该模型P值小于0.01，而失拟项P值大于0.10不显著，表明该模型对试验的拟合情况良好，误差较小，可以通过该模型预测试验结果。各因素对葡萄籽多酚提取量的影响由大到小依次为提取温度（A）、乙醇体积分数（C）、提取时间（B）、液料比（D）。
由图2可以看出，温度与提取时间，乙醇体积分数与物料比，乙醇体积分数与温度的交互作用图中均存在极点，说明交互作用显著，与二次模型方差分析结果一致。图2（a）显示，在一定范围内，温度和提取时间一定的情况下，浸提时间在2h左右，浸提温度在82℃左右时，多酚提取量较高。可以看出，随着温度的升高提取量逐渐增大，但超过85℃后，提取量迅速减小。可能是温度过高使部分多酚氧化，从而影响了提取量。由图2（b）显示，当提取温度和时间一定时，多酚提取量随乙醇体积分数和物料比都是呈现先的升高后下降的趋势，在乙醇体积分数大约在60%、液料比大约在20时，达到最大值。由图2（c）可以看出，在提取时间和物料比一定的情况下，多酚提取量随浸提温度和乙醇体积分数的不同变化显著，浸提温度达到大约80℃左右，体积分数为60%左右时，提取量较高。
2.4 响应面结果分析及验证实验
响应面分析结果得到最佳提取工艺参数为：当乙醇体积分数59.39%，提取时间2h，提取温度82.90℃，液料比21.03时葡萄籽多酚提取量达35.66mg/g。为方便实际操作，将工艺参数修订为[9]：乙醇体积分数60%，提取时间2h，提取温度82.9℃，液料比21，实际测得多酚提取量为35.51mg/g。
3 结论
通过福林酚法对葡萄籽多酚含量进行测定，所得多酚含量较高，对多酚的测定具有一定的实验参考价值。通过单因素试验和响应面分析优化得到的提取多酚的最佳工艺条件为乙醇体积分数59.39%、提取时间2h、提取温度82.90℃、液料比21.03，实际多酚提取量为35.51mg/g，与预测值基本吻合。影响浸提效果的主要因素是温度，其次是乙醇体积分数，对浸提效果影响最小的是物料比。
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