黄丽俊1,2，李利东1，宓晓黎1
（1江苏省微生物研究所有限责任公司，江苏无锡214063；2江苏省菩德食品安全检测技术有限公司，江苏无锡214063）摘要：对已有方法和规范中样品前处理方法和色谱条件进行了优化和对比研究，建立检测虫草制品中腺苷和虫草素含量的反相高效液相色谱方法。样品经水超声提取40 min，离心过滤后进行分析。采用C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以水-甲醇(85:15，V/V)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为260 nm。本方法检测限为0.2 μg/mL，定量限为1.0 μg/mL。以所建立的方法对虫草制品进行分析，样品加标回收率在94%~103%，相对标准偏差均小于3%。该检测方法简便、准确，并能同时测定腺苷和虫草素。
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关键词 ：虫草制品；高效液相色谱；腺苷；虫草素
中图分类号：O657.7+2 文献标志码：A 论文编号：2014-0289
基金项目：无锡市社会发展科技支撑计划“构建食品中非法添加物快速检测关键技术集成及应用”(CSE01N1205)。
第一作者简介：黄丽俊，女，1981 年出生，助理研究员，硕士研究生，研究方向：保健食品产品开发及检测。通信地址：214063 江苏省无锡市钱荣路7号，Tel：0510-85500626，E-mail：huangchen2004@163.com。
通讯作者：黄丽俊，女，1981 年出生，助理研究员，硕士研究生，研究方向：保健食品产品开发及检测。通信地址：214063 江苏省无锡市钱荣路7 号，Tel：0510-85500626，E-mail：huangchen2004@163.com。
收稿日期：2014-03-24，修回日期：2014-09-26。
Determination of Adenosine and Cordycepin in Cordyceps Preparation by HPLC
Huang Lijun1,2, Li Lidong1, Mi Xiaoli1(1Jiangsu Institute of Microbiology Co. Ltd., Wuxi 214063, Jiangsu, China;2Jiangsu Provincial Food Safety Testing Co., Ltd., Wuxi 214063, Jiangsu, China)Abstract: To establish the quantitative analysis method for adenosine and cordycepin in Cordyceps sinensis byHPLC. The sample was extracted with pure water under ultrasonic for 40 min. After centrifugation andfiltration, the extract was analyzed by HPLC with C18 column at 1.0 mL/min and detected at 260 nmwavelength. The mobile phase was composed of pure water and methanol(85:15, V/V) and the columntemperature was 30℃ . This method showed the LOD was 0.2 μg/mL, LOQ was 1.0 μg/mL. The averagerecoveries of adenosine and cordycepin were 94%- 103% and RSD bellow 3% . The method had highsensitivity, selectivity and simple operation, and can be used for testing the adenosine and cordycepin.
Key words: Cordyceps Preparation; HPLC; Adenosine; Cordycepin
草素。农业部标准NY/T 2116—2012[9]可同时检测虫草中腺苷和虫草素，但提取时间过长。近年来国内采用高效液相色谱法测定蛹虫草中腺苷和虫草素含量的报道较多[10-15]，腺苷和虫草素等核苷类成分是虫草的主要功效成分，因此对这2 种成分的检测尤为重要。本研究目的是尽量简化样品前处理步骤，避免使用有毒有机溶剂，优化HPLC方法，建立同时测定虫草制品中腺苷和虫草素的HPLC方法。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
研究室内试验在江苏无锡进行。
1.2 仪器与试剂
戴安UltiMate3000 高效液相色谱仪，UltiMate3000紫外检测器，Chromeleon 色谱工作站；KQ-100B 超声波清洗器，腺苷、虫草素对照品（中国药品生物制品检定所），甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。
1.3 试验方法
1.3.1 标准溶液的配制准确称取腺苷对照品0.0190 g，用流动相溶解并定容至25 mL容量瓶，称取虫草素对照品0.0160 g 用流动相溶解并定容至50 mL容量瓶，分别配制成含腺苷0.76 mg/mL 和虫草素0.32 mg/mL的标准溶液。
（1）混合标准液：分别取上述标准溶液1 mL于10 mL容量瓶中，水定容至刻度，配制成含腺苷76 μg/mL 和虫草素32 μg/mL的混合标准液。
（2）标准曲线浓度：将混合标准液梯度稀释分别配制成腺苷浓度为2.375、4.75、9.5、19、38 μg/mL，虫草素浓度为1、2、4、8、16 μg/mL的系列标准溶液。1.3.2 样品的前处理将蛹虫草制品混和均匀，精确称取样品1.0 g 于50 mL离心管中，加入25 mL提取液后超声提取，提取结束后用提取液定容至刻度，混匀后以10000 vpm离心10 min，经0.45 μm滤膜过滤后供液相色谱分析用。
1.3.3 色谱条件色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm，5 μm)；流动相：水-甲醇(85:15，V/V)；流速1.0 mL/min；进样量为20 μL；柱温30℃；检测波长260 nm。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法的优化
2.1.1 提取溶剂的选择中国药典中用90%甲醇加热回流提取，《规范》中用60%乙醇提取，农业部标准中用水提取，笔者分别比较了同等处理条件下，水、60%乙醇、90%甲醇、100%乙醇5 种溶剂提取效果，结果显示以水提取效果最好，检测结果见表1。
由表1 可知，所测样品中腺苷和虫草素含量均随提取液中乙醇体积分数的增加而降低，用水提取的含量最高，这与农业部标准使用的提取溶剂一致。
2.1.2 提取时间的选择同一个样品，用水作为提取剂，分别超声提取10、40、80、180 min，结果见表2。由表2 可知，在水做提取溶剂的条件下，提取时间短则提取不完全，超声40 min 时虫草素含量达到最大，随着超声时间延长提取效果没有增加，所以提取时间定为40 min。
2.2 液相色谱条件的选择
2.2.1 流动相的选择中国药典和《规范》中选用磷酸盐溶液与甲醇的混合体系作为流动相，而长期使用盐相会减少色谱柱的使用寿命，从而增加检测成本。农业部标准中选用乙腈-水(5:95，V/V)作为流动相，考虑到乙腈的毒性较大，笔者采用不同比例的甲醇-水作为流动相，对腺苷和虫草素的分离效果进行比较，最终确定甲醇-水(15:85，V/V)为流动相，流速1.0 mL/min，在此条件下，标准品和样品中腺苷和虫草素能得到很好分离，色谱图见图1，样品图谱中腺苷和虫草素的保留时间与对应的标准品色谱图一致，并且与其相邻色谱峰的分离度大于1.5。
2.2.2 检测波长的选择取腺苷和虫草素对照品溶液在200~400 nm进行紫外扫描，发现腺苷和虫草素的最大吸收波长为260 nm，因此确定检测波长为260 nm。
2.3 方法学考察
2.3.1 方法标准曲线、检出限、定量限将标准系列依次进样，进样量均为20 μL，以标准品浓度(X)为横坐标，对应的峰面积(Y)为纵坐标，对标准系列进行线性回归，得腺苷标准系列(2.375~38 μg/mL)的回归方程为：Y=0.981X+0.2074，r=1；虫草素标准系列(1.00~32.0μg/mL)的回归方程为：Y=0.9795X+0.0806，r=1。腺苷和虫草素在上述浓度范围内线性关系良好。测定色谱峰达到3 倍信噪比时，对应的加标浓度为检出限；达到10 倍信噪比时，对应的加标浓度为定量限。即本方法检出限为0.2 μg/mL，定量限1.0 μg/mL。
2.3.2 重复性试验取6 份平行样品，按照优化后的条件进样检测，结果样品中腺苷、虫草素的平均质量分数分别为227、74.5 mg/100 g，RSD 分别为1.12%和1.35%(n=6)，表明本方法的重复性良好。
2.3.3 稳定性试验样品用水超声提取40 min 后，分别放置0、4、8、12、24 h 后进样，测定腺苷、虫草素的峰面积，结果腺苷、虫草素的峰面积的RSD 分别为2.12%和1.56%，表明试验提取的溶液，腺苷和虫草素的含量在24 h内保持相对稳定。
2.3.4 方法准确度及精密度取已知含量的3 种虫草制品，按照1.3.2 章节下提到的方法处理，在1.3.3 条件下测定，同时进行样品加标回收试验，每个样品每个添加水平取平行样3 份，计算方法回收率和精密度，结果见表3。加标回收率在94%~103%，相对标准偏差均小于3%。说明该方法加标回收效果较好，适合于虫草制品含量测定。
3 讨论
农业部标准NY/T 2116—2012 虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法可以很好地分离虫草素和腺苷，但是需要用水超声提取3 h，耗时较长，本试验对不同提取时间进行比较，发现提取40 min 后随着超声时间延长腺苷虫草素含量没有提高。
《保健食品检验与评价技术规范》2003 版和中国药典2010 版冬虫夏草项下腺苷含量测定，都采用磷酸盐溶液与甲醇的混合体系作为流动相，作者比较几种流动相分离效果，水-甲醇(85:15，V/V)作为流动相时样品中腺苷和虫草素的色谱峰分离度大于1.5，能够得到很好地效果，同时此流动相避免磷酸盐对色谱柱的损伤。本研究建立的液相色谱方法操作简单，检测结果稳定性好、准确度高，适合于虫草制品中腺苷和虫草素定性定量分析。
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