邹继红1，王洪斌2，赵春杰3
（1.赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000；2.赤峰市传染病防治医院，内蒙古 赤峰 024000；
3.沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）
摘 要：目的：建立测定伊赫乌兰-13中苦参碱含量的HPLC法.方法：采用Shim-pack C18柱，流动相为甲醇-0.1%磷酸-乙腈=10∶9∶6（三乙胺调pH7.2），检测波长为210nm，流速为1.0mL·min-1.结果：苦参碱的浓度在8.4μg·mL-1～84μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性，回归方程为：Y＝46.003X-1.206，（r＝0.9999）；平均加样回收率为98.9%，RSD=1.4%（n=9）.结论：建立的方法简便、快速、准确，适用于控制伊赫乌兰-13中苦参碱的含量.
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关键词 ：HPLC；苦参碱；伊赫乌兰-13；含量测定
中图分类号：R927.2文献标识码：A文章编号：1673-260X（2015）08-0062-02
基金项目：内蒙古自然科学基金资助项目（2013MS1217）
蒙药伊赫乌兰-13由土木香、苦参、栀子、茜草、悬钩子木、山柰、诃子、川楝子、枇杷叶、紫草茸、橡子、紫草、金莲花组成，具有清血热之功效，临床上主要用于头痛、血热上盛、目赤、高血压等病症[1].对于方中主药苦参中苦参碱的含量测定，作者未见其他文献报道，为了合理有效控制该制剂的内在质量，作者参考部分相关文献，以苦参的活性成分苦参碱作为测定指标，采用HPLC测定其含量，经过方法学考察证明该方法操作简便，重现性良好，专属性较强，方中其它组分对苦参碱的测定无干扰，可作为伊赫乌兰-13的质量控制方法.
1 试剂与仪器
1.1 试剂
苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110805-201401）；用于配制流动相的甲醇和乙腈均为色谱纯，用于提取样品的甲醇为分析纯，磷酸、氨水、三氯甲烷、无水乙醇与三乙胺为分析纯；娃哈哈纯净水.蒙药伊赫乌兰-13（内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室，批号：20140107，20140502，20140706）；阴性对照品的药材（购自内蒙古赤峰市中蒙医院）.
1.2 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪；KQ-250E型超声波清洗器；METTLER AE240电子天平；UV765紫外可见分光光度计；HH-6数显恒温水浴锅；pHS-3C酸度计.
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Shim-pack C18色谱柱（250mm×4.6mm，内径5μm），柱温为室温，流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸=6∶10∶9（用三乙胺调节pH为7.2），检测波长为210nm，流速为1.0mL·min-1，进样体积为20μL.
2.2 溶液的制备
2.2.1 苦参碱对照品溶液的配制
取10.5mg苦参碱对照品，精密称定，置25mL量瓶中，加流动相适量使之溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到420μg·mL-1的苦参碱对照品贮备液.精密吸取该贮备液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mL，分别置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，得到一系列苦参碱的对照品溶液.
2.2.2 供试品溶液的制备
取研细的伊赫乌兰-13细粉5.0g，精密称定，置于250mL具塞锥形瓶中，加入氨水5mL使润湿，再加无水乙醇50mL，密塞，超声处理30min，放冷，滤过，滤器与容器用无水乙醇20mL分4次洗涤，合并洗液与滤液，水浴蒸干，残渣用无水乙醇溶解，定容至10mL，摇匀.用0.45μm微孔滤膜滤过，制得供试品溶液.
2.2.3 阴性样品溶液的制备
按处方要求制备不含苦参碱药材的样品，同法制成阴性样品溶液，滤过.
2.3 专属性测试
取阴性样品溶液、苦参碱对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件，分别进样20μL，测定，色谱图如图1所示.由图可知：苦参碱的保留时间约7.2min，阴性样品对苦参碱的测定无干扰，苦参碱与其他组分可达到基线分离.
2.4 线性范围的测试
分别精密吸取系列苦参碱对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，苦参碱的浓度（μg·mL-1）为横坐标，进行线性回归，回归方程为：Y=46.003X–1.206，（r=0.9999）.结果表明：苦参碱的浓度在8.4μg·mL-1～84μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性.
2.5 精密度测试
精密吸取50.4μg·mL-1的苦参碱对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，重复6次，对照品的RSD=0.4%，样品的RSD=1.2%，结果表明仪器的精密度良好.
2.6 稳定性测试
精密吸取同一份供试品溶液，分别于室温放置0、1、2、4、6、8、10h，注入色谱仪，测定峰面积.苦参碱峰面积的RSD=1.3%，结果表明供试品溶液在10h内保持稳定.
2.7 重复性测试
精密称取同一批样品（批号：20140903），按“2.2”项下的方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项的色谱条件进样测定.样品中苦参碱的平均含量为0.085mg·g-1，RSD=1.1%，结果表明方法的重复性良好.
2.8 加样回收率试验
精密称取4.0g已知苦参碱含量的同一批（批号：20140903，含量为0.085mg·g-1）样品粉末9份，分别精密加入210μg·mL-1的苦参碱对照品溶液1.6、1.8和2.0mL，按“2.2”项方法处理，精密吸取20μL，注入色谱仪，测定峰面积，计算苦参碱的回收率，结果见表1.
2.9 样品测定
取3个批号的样品，按“2.2”项方法处理后，精密吸取供试品溶液和苦参碱对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，外标法计算苦参碱的含量，结果见表2.
3 讨论
采用UV-765紫外-可见分光光度计扫描苦参碱对照品溶液的紫外吸收光谱，苦参碱的最大吸收波长为210nm，故测定时选取210nm为测定波长.在筛选流动相的过程中，参考相关文献尝试采用甲醇-水-四氢呋喃[2-4]、甲醇- 0.1%磷酸溶液[5-6]等作为流动相，但苦参碱的色谱峰严重拖尾.经多次试验，最后当采用甲醇-乙腈-0.1%磷酸=10∶6∶9（用三乙胺调pH为7.2）时，苦参碱的拖尾因子合格，与其他组分分离良好，而且流动相的组成简单，容易配制.实验过程中将无水乙醇、甲醇和三氯甲烷提取后样品中苦参碱的含量进行对比，结果发现无水乙醇的提取率高，杂质峰少，分离度合格，且试剂的毒性低，所以最终采用无水乙醇为提取溶剂.
此外，还测定了超声提取20、30和40min的样品，结果发现提取30min和40min的样品中苦参碱的含量比较接近，所以最终采用超声30min.
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参考文献：
（1）中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册[S].1998.73.
（2）李雨生.乌兰十味散中苦参碱的含量测定[J].北方药学，2010，7（2）：41-42.
（3）周桂坤，莫日根高娃，哈斯高娃，等.RP-HPLC法测定乌兰三味汤散中苦参碱的含量[J].中国药事，2003，17（10）：624-626.
（4）李丽.HPLC法测定蒙药乌兰三味汤散剂中茜草素含量[J].中国民族医药杂志，2012（6）：51-52.
（5）姜哲，孙良鹏，许红兰.反相高效液相色谱法测定不同地区不同采集期茜草中茜草素的含量[J].时珍国医国药，2008，19（7）：1719-1720.
（6）张宁，杨晓宏，马晓帆.HPLC法测定十三味菥蓂胶囊中苦参碱的含量[J].药物分析杂志，2007，27（9）：1475-1477.