摘 要：目的:优选山楂叶总黄酮脂质体制备工艺，为山楂叶中医食疗产品开发提供制剂基础。方法:以山楂叶总黄酮为原料，采用薄膜分散-超声法，以包封率为评价指标，在单因素试验基础上，选取影响较大的因素做4因素3水平正交试验设计，优化制备工艺。结果:脂质体最佳制备工艺为卵磷脂与胆固醇质量比5∶1、卵磷脂浓度30 mg/mL、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量为10∶1、吐温80添加量占卵磷脂质量比为10%，在该条件下制备的脂质体呈淡黄色，包封率、粒径及Zeta电位分别为（73.25±2.13）%、（132.2±2.85）nm、（-9.29±0.34）mV。贮藏稳定性结果显示在4℃条件下稳定性较好。结论:山楂叶总黄酮脂质体有良好的理化性质，在4℃条件下贮藏稳定性较好，可为产品开发提供依据。
关键词:山楂;黄酮;中医食疗;脂质体;包封率;稳定性;实验研究;
Preparation technology of Chinese medicine dietary preparations with total flavonoids from hawthorn leaves
XUE Yutong ZHENG Jinxiu SHAO Ying
LIANG Taigang YANG Lijun
School of Basic Medical sciences. Shanxi Medical University
Abstract：Objective∶To optimize the preparation process of hawthorn leaf total flavonoid liposomes and to provide a preparation basis for developing hawthorn leaf traditional Chinese medicine(TCM)dietary products. Methods∶The raw materials were total flavonoids of hawthorn leaves,using the thin-film dispersion-ultrasonic method and the encapsulation efficiency as the evaluation index. The factors with greater influence were selected for a four-factor and three-level orthogonal experimental design based on the single-factor experiment to optimize the preparation. Results∶The optimal preparation process of liposomes was as follows∶the mass ratio of lecithin to cholesterol was 5∶1,the concentration of lecithin was 30 mg/mL,the mass of lecithin and the total flavonoids of hawthorn leaves was 10∶1,and the addition amount of Tween 80 accounted for 30 mg/mL of lecithin. The mass ratio is 10%,and the liposomes prepared under this condition are pale yellow. The encapsulation efficiency,particle size,and Zeta potential were(73. 25±2. 13)%,(132. 2±2. 85)nm,(-9. 29±0. 34)mV,respectively. The storage stability results showed that the stability was better at 4 ℃. Conclusions∶The total flavonoid liposomes from hawthorn leaves had good physical and chemical properties and good storage stability at 4 ℃,which could provide a basis for product development.
Keyword：
hawthorn; flavonoids; traditional Chinese medicine diet therapy; liposomes; encapsulation efficiency; stability; experimental study;
随着人们生活水平的提高，中医食疗得到越来越多人的认可。中医食疗是以中医理论为指导，选取具有药用价值的食物治疗疾病[1]。通过食疗，补充人体所需的营养素，使机体达到均衡营养的状态。黄酮类化合物是许多药用植物的有效成分，在自然界中广泛分布于水果、蔬菜、茶、植物根茎、花部位[2,3]，在水果、蔬菜中含量最高[4],是人体所需的天然营养素之一[5],在降血糖、降血脂、抗感染和抗肿瘤等方面发挥重要作用。山楂叶总黄酮是山楂叶的提取物，具有广泛的药理作用。益心酮片的主要成分是山楂叶的提取物[6]，临床用于治疗冠心病、心绞痛、高脂血症等病症，但该生物制剂尚未改变黄酮类化合物口服难吸收、生物利用度低的不足。脂质体是一种安全、无毒、具有靶向给药功能的新型药物制剂[7]，可以包封水溶性、脂溶性及两亲性的物质，在医药界、食品界及保健品界有着非常广泛的应用[8,9,10]，以增强食品的感官属性、保质期，增加产品的溶解度及生物利用度[11]。本研究以山楂叶提取物总黄酮为原料，采用薄膜分散-超声法制备脂质体，并通过正交试验优选脂质体的制备工艺，对其理化性质及贮藏稳定性进行探究，以期为后期开发食疗产品提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆卵磷脂、胆固醇、芦丁标准品、吐温80（北京索莱宝科技有限公司）；二氯甲烷、无水乙醇、亚硝酸钠、无水三氯化铝、氢氧化钠、甲醇均为分析纯（天津风船化学试剂科技有限公司）。
1.2 仪器
SB25-12DTD超声波清洗，UP-250手提式超声波细胞粉粹机（宁波新芝生物科技有限公司）；Spectra Max 190型酶标仪（美国Molecular Devices公司）；Nano ZS 90激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 山楂叶总黄酮脂质体的制备
参照涂清波等[12]研究方法稍作改动。采用薄膜分散-超声法制备山楂叶总黄酮脂质体。称取一定量的大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80按一定比例溶于二氯甲烷中，山楂叶黄酮溶于70%乙醇中，充分溶解后置于茄形瓶中，低压旋转蒸发除去有机溶剂，待形成薄膜后，加入一定量磷酸盐缓冲液（PBS）水化洗膜，将悬浊液经过超声波细胞粉碎机在一定功率下超声一定时间，最后过0.45μm滤膜，即得脂质体。
1.3.2 单因素考察
1.3.2. 1 卵磷脂与胆固醇质量比对脂质体包封率的影响
固定卵磷脂浓度20 mg/m L、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10∶1、吐温80添加量占卵磷脂质量比20%、PBS的p H 7.4、超声功率20%、超声时间5 min，考察卵磷脂与胆固醇质量比分别为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1时对脂质体包封率的影响。
1.3.2. 2 卵磷脂浓度对脂质体包封率的影响
固定卵磷脂与胆固醇质量比4∶1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10∶1、吐温80添加量占卵磷脂质量比20%、PBS的p H 7.4、超声功率20%、超声时间5 min，考察卵磷脂浓度（在PBS中的浓度）分别为5 mg/m L、10 mg/m L、20 mg/m L、30 mg/m L、40 mg/m L时对脂质体包封率的影响。
1.3.2. 3 卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比对脂质体包封率的影响
固定卵磷脂浓度20 mg/m L、卵磷脂与胆固醇质量比4∶1、吐温80添加量占卵磷脂质量比20%、PBS的p H 7.4、超声功率20%、超声时间5 min，考察卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比分别为20∶1、10∶1、10∶2、10∶3、10∶4时对脂质体包封率的影响。
1.3.2. 4 吐温80添加量占卵磷脂质量比对脂质体包封率的影响
固定卵磷脂浓度20 mg/m L、卵磷脂与胆固醇质量比4∶1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10∶1、PBS的p H 7.4、超声功率20%、超声时间5 min，考察吐温80添加量占卵磷脂质量比分别为10%、15%、20%、25%、30%时对脂质体包封率的影响。
1.3.2. 5 PBS的p H对脂质体包封率的影响
固定卵磷脂浓度20 mg/m L、卵磷脂与胆固醇质量比4∶1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10∶1、吐温80添加量占卵磷脂质量比20%、超声功率20%、超声时间5 min，考察PBS的p H分别为6.6,7.0,7.4,7.8,8.2时对脂质体包封率的影响。
1.3.2. 6 超声功率对脂质体包封率的影响
固定卵磷脂浓度20 mg/m L、卵磷脂与胆固醇质量比4∶1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10∶1、吐温80添加量占卵磷脂质量比20%、PBS的p H 7.4、超声时间5 min，考察超声功率分别为10%、20%、40%、60%、80%时对脂质体包封率的影响。
1.3.2. 7 超声时间对脂质体包封率的影响
固定卵磷脂浓度20 mg/m L、卵磷脂与胆固醇质量比4∶1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10∶1、吐温80添加量占卵磷脂质量比20%、PBS的p H 7.4、超声功率20%，考察超声时间分别为1 min、3 min、5 min、7 min、9 min时对脂质体包封率的影响。
1.3.3 正交试验
在单因素试验基础上，选取对包封率影响较大的4因素进行L9(34)4因素3水平正交试验方案设计，优化脂质体的制备工艺，试验因素及水平见表1。
1.3.4 黄酮含量测定
1.3.4. 1 标准曲线绘制
根据文献[13,14]方法，准确称取适量芦丁标准品，用70%乙醇完全溶解，配制质量浓度为1 mg/m L芦丁标准溶液，采用倍比稀释法制备质量浓度分别为0.500 mg/m L、0.250 mg/m L、0.125 mg/m L、0.063 mg/m L、0.031 mg/m L的芦丁标准溶液。精密吸取50μL芦丁标准溶液，加入5%Na NO2溶液20μL，静置5 min；加入10%Al Cl3溶液20μL，静置6 min；最后加入4%Na OH溶液200μL，静置15 min，在酶标仪中振荡3 s，于510 nm处测定吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.4. 2 含量测定
按照上述1.3.4.1中方法，自“加入5%Na NO2溶液20μL，静置5 min”起，到“于510 nm处测定吸光度”。然后按照公式（1）计算山楂叶总黄酮。
式中∶M——山楂叶总黄酮含量，mg/g;C——对应标准曲线计算得出的反应液总黄酮质量浓度，mg/m L;V——反应液体积，m L;W——原料质量，g。
1.3.5 包封率的测定
参照文献[15]方法做适当修改。精密量取脂质体1 m L，加入50 m L甲醇破乳后再稀释10倍，于510 nm处测吸光度，计算黄酮含量（M总）。精密量取脂质体1 m L,4℃，10 000 r/min离心30 min，取上清液10μL，甲醇定容至5 m L，测定吸光度，计算游离黄酮含量（M游），按照公式（2）计算包封率。
式中∶R——包封率，%；M总——黄酮含量，mg/g;M游——为游离黄酮含量，mg/g。
1.3.6 粒径及电位测定
用去离子水将样品稀释适当倍数，采用Nano ZS 90激光粒度仪测定脂质体粒径及Zeta电位。
1.3.7 透射电镜图像
根据文献[16]方法，用去离子水将样品稀释适当倍数，采用磷钨酸负染法染色观察脂质体形态。
1.3.8 温度对山楂叶总黄酮脂质体贮藏稳定性的影响
将脂质体密封分别在4℃、25℃条件下避光贮藏28 d，以外观、包封率为指标，评价脂质体贮藏稳定性，外观评价标准如下：（-）表示淡黄色，均一、无絮凝和沉淀；（-+）表示淡黄色，有少量絮凝和沉淀、振荡后溶解；（+)表示黄色，有少量絮凝和沉淀、振荡后溶解；(++)表示黄色，有大量絮凝和沉淀、振荡后不溶解。
1.4 数据分析
实验重复3次，采用spss 25.0软件进行数据处理，结果以均数±标准差描述。使用Graph Pad Prism 6.02作图。
2 结果
2.1 单因素考察
2.1.1 卵磷脂与胆固醇质量比对脂质体包封率的影响
结果如图1所示，在一定范围内，脂质体包封率随着卵磷脂与胆固醇质量比的增加而增大，当比例超过4∶1时，呈下降趋势。因此，卵磷脂与胆固醇质量比在（3∶1)～(5∶1）范围内较为合适。
2.1.2 卵磷脂浓度对脂质体包封率的影响
由图2可知，随着卵磷脂浓度的增加，脂质体包封率呈先升后降趋势。当卵磷脂浓度为20 mg/m L时，包封率最大，然后开始下降。故卵磷脂浓度10～30 mg/m L范围内为宜。
2.1.3 卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比对脂质体包封率的影响
由图3可以看出，脂质体包封率随着卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比的改变而改变。当质量比为10∶2时，脂质体包封率较高；质量比为10∶4时，脂质体包封率极低。因此，质量比在（10∶1)～(10∶3）范围内较为适宜。
2.1.4 吐温80添加量占卵磷脂质量比对脂质体包封率的影响
实验结果见图4，吐温80添加量占卵磷脂质量比会影响包封率大小。当吐温80添加量为15%时，包封率最高，之后随着添加量的增加，包封率降低。所以，吐温80添加量占卵磷脂质量比宜控制在10%～20%范围内。
2.1.5 PBS的p H对脂质体包封率的影响
图5结果表明，PBS的p H对脂质体包封率的影响较小。当p H为6.6时，脂质体包封率最高，故选取p H 6.6进行实验。
2.1.6 超声功率对脂质体包封率的影响
从图6可知，超声功率对包封率的影响呈先升后降趋势。当超声功率为60%时，包封率最高，但散热较多，且超声过程中易产生泡沫。因此，综合考虑选择超声功率为40%。
2.1.7 超声时间对脂质体包封率的影响
由图7结果可得，超声时间对包封率的影响较小，包封率随着超声时间的增加出现下降趋势。当超声时间为1 min时包封率最高，故实验选择超声时间为1 min。
2.2 正交优化试验
由以上结果可知，影响脂质体包封率的因素较多，为优化脂质体的制备工艺，选取影响较大的因素，即卵磷脂与胆固醇质量比（A）、卵磷脂浓度（B）、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比（C）、吐温80添加量占卵磷脂质量比（D），做4因素3水平正交试验。试验方案及结果如表2、表3所示。
根据以上结果可知，各因素对包封率影响的先后顺序为：吐温80添加量占卵磷脂质量比>卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比>卵磷脂与胆固醇质量比>卵磷脂浓度。通过均值k分析得出最佳制备条件为A3B3C1D1，即卵磷脂与胆固醇质量比5∶1、卵磷脂浓度30 mg/m L、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10∶1、吐温80添加量占卵磷脂质量比10%。在此条件下制备3批脂质体，测定包封率分别为71.80%、75.69%、72.25%，平均为（73.25±2.13）%。
2.3 脂质体理化性质初步研究
2.3.1 外观、粒径、电位
根据最佳制备条件，制备山楂叶总黄酮脂质体，由于黄酮类化合物本身特性，脂质体呈淡黄色、均一的液体。粒径如图8所示，粒径为（132.2±2.85)nm。Zeta电位如图9所示，脂质体带负电荷，电位为（-9.29±0.34)m V。
2.3.2 透射电镜（TEM）图像
图10为脂质体×25 000倍的TEM图像，可见脂质体为球形或椭球形，表面较光滑，分布均匀。
2.4 温度对山楂叶总黄酮脂质体的贮藏稳定性的影响
2.4.1 外观
外观变化可直接评价脂质体的稳定性，在4℃条件下，脂质体外观无明显变化，无絮凝和沉淀产生。在25℃条件下，自14 d开始出现少量絮凝和溶解，28 d时颜色发生改变，絮凝和沉淀振荡后溶解。
2.4.2 温度对脂质体包封率的影响
结果如图11所示，不同贮藏温度可以导致脂质体包封率的改变。随着时间的延长，两种贮藏温度都可导致脂质体包封率下降，在25℃条件下，脂质体包封率下降较大，到28 d时，包封率仅为20%左右，而在4℃条件下包封率则在40%以上。由此可见，脂质体在4℃条件下贮藏更稳定。
3 讨论
药食同源物质是指某种膳食同时具备药品和食品两种属性，许多保健类的食品都属于该类物质。发挥药食同源作用，不仅可以弘扬中医药文化，促进中药产业多元化，还可以服务于“健康中国”计划[17]。郝晓蓓等[18]采用Cite Space对我国近10年中医食疗研究热点及趋势进行了分析，发现主要集中于中医食疗的临床疗效、药食同源、中西医结合护理和慢性病的防治及推广运用等。由此可见，中医食疗理念已深入人心并应用于许多方面。山楂是一种药食同源物质，山楂果有健胃消食功效，山楂叶的应用相对较少，本研究对其进行利用，避免了有益物质的浪费。脂质体是指活性物质被类脂双分子层包封而形成的闭合囊泡，结构与细胞膜相似[19]，具有靶向性、长效性、生物相容性、低免疫原性等特点。脂质体有多种制备方法，如薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸发法、复乳法等。薄膜分散法操作简单，耗时短，包封率较高,适用于脂溶性物质的包封，超声可以减小脂质体的粒径。包封率反映药物被载体包封的程度，是脂质体质量评价的一个重要指标，包封率越高，药物被利用的程度越高[20]。张朋[21]通过薄膜分散-超声法制备的鱼油脂质体平均包封率为71.21%；白彩萍等[22]通过该法制备格列本脲类脂质体，包封率为82.50%；而陈玉菲等[23]采用薄膜分散法制备羟基积雪草苷脂质体，包封率仅为（39.30±1.06）%。本研究采用薄膜分散-超声法制备的脂质体包封率为（73.25±2.13）%，处于较高水平，介于张朋[21]和白彩萍等[22]的研究之间，远高于陈玉菲等[23]的研究。该方法简单可行，提高了山楂叶总黄酮的包封率，山楂叶总黄酮的利用程度会有所提高，而包封率有所差异则可能与脂质体包封的药物不同有关。随着贮藏时间的延长，被包封的药物会有所泄露，包封率随之下降，这与脂质体的稳定性有关。本研究将山楂叶总黄酮脂质体分别在4℃、25℃条件下避光保存28 d，以外观及包封率为指标考察稳定性，结果显示在25℃条件下包封率下降较快，该结果与张朋等[21,24]研究结果一致，说明结果具有可靠性，脂质体在4℃条件下稳定性较好。
4 小结
本研究采用薄膜分散-超声法将山楂叶总黄酮包封于脂质体中，通过单因素及正交试验得出最佳制备工艺，结果显示在该条件下制备的脂质体具有良好的理化性质，在4℃条件下有较好的贮藏稳定性。因此，该制备工艺具有一定的可行性，可为后期开发山楂叶总黄酮中医食疗相关产品提供较好的制剂基础，该制剂能够发挥黄酮类化合物的药理作用，在高血糖、高血脂等人群中有一定的应用前景，但开发食疗产品尚需进行产品配方及动物、临床相关试验的研究。
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