尚发军 艾文兵 熊志云 冯定坤 彭 智
三峡大学医学院神经外科，湖北宜昌 443000
[摘要] 目的 检测整合素αvβ3拮抗剂SB-273005对C6神经胶质瘤细胞talin、survivin蛋白表达量及其磷酸化的影响。方法将C6细胞常规培养后，分对照组（0 mg/L）、SB-273005低浓度组（25 mg/L）和SB-273005高浓度组（50 mg/L）3组，采用western法检测不同浓度的SB-273005对C6细胞踝蛋白（talin）、生存素蛋白（survivin）表达量以及其磷酸化的变化，并检测各组蛋白条带光密度变化。 结果 不同浓度的SB-273005均能明显降低C6细胞talin、survivin蛋白的表达，对二者的磷酸化有明显的抑制作用。测得对照组、SB-273005低浓度组和SB-273005高浓度组蛋白条带光密度，得出talin/β-actin比值分别为0.76、0.43、0.26（*P<0.05）；磷酸化的talin/β-actin比值分别为0.82、0.33、0.15（*P<0.05)。survivin/β-actin比值分别为0.84、0.21、0.09.（*P<0.05），磷酸化的survivin/β-actin比值分别为0.19、0.04、0.01（*P<0.05)。3组相比，差异有统计学意义。结论 SB-273005对大鼠C6神经胶质瘤细胞talin、survivin蛋白表达量及其磷酸化起负性调节作用。
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关键词 C6神经胶质瘤细胞；踝蛋白；生存素； SB-273005
[中图分类号] R3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）12（a）－０044-02
目前研究发现，在胶质瘤细胞中，talin、survivin所能发挥的生物学作用与整合素αvβ3的活性状态密切相关[1]。talin与survivin蛋白的磷酸化水平与胶质瘤恶性程度存在关联性，胶质瘤的恶性程度越高，二者的磷酸化水平随之增高[2]。因此，该实验2013年12月—2014年6月间通过采用整合素αvβ3拮抗剂SB-273005，抑制整合素活性，观察整合素αvβ3的活性改变后与talin、survivin的表达量及其磷酸化是否存在相关性，并探讨其作用机制，以期为脑胶质瘤的治疗寻求更有效的方法，报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
实验自2013年12月开始，2014年6月结束。C6神经胶质瘤细胞由南方医科大学神经外科实验室提供；整合素αvβ3拮抗剂SB-273005为Dupont公司产品；抗talin抗体、survivin抗体、survivin磷酸化单克隆抗体购于武汉博士德生物公司； DMEM培养基、FBS、RIPA缓冲液、TBST液、HRP-羊抗兔LgG、Rabbit Anti-β-Actin等试剂由广州赛哲生物科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞样品制备 大鼠C6细胞常规培养，待其进入对数生长期后，调整细胞培养浓度为1×104～1×105/mL，并分为对照组（0 mg/L）、nm23-H2低浓度组（25 mg/L）和nm23-H2高浓度组（50 mg/L）3组，20 h后收集细胞样品，加入RIPA裂解缓冲液收集裂解物，取上清备用。
1.2.2 Western Blotting 样品行SDS-PAGE, 电转移于PVDF膜上，牛奶封闭液封闭2~4 h，依次加入一抗（抗talin、survivin及对应磷酸化抗体1∶1 000稀释，室温2 h后，加羊抗兔二抗（1∶400 0），2 h后显影。Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数。
1.3 统计方法
采用spss20.0统计软件包处理数据，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，用 t检验。
2 结果
2.1 不同浓度的SB-273005均可明显抑制C6细胞talin表达量及磷酸化
加入不同浓度的SB-273005均可明显抑制talin表达量及磷酸化，且随着SB-273005浓度升高，其对talin表达及磷酸化的抑制呈增高趋势，见图1，2，3。
2.2 不同浓度的SB-273005均可明显抑制C6细胞survivin表达量及磷酸化
加入不同浓度的SB-273005均可明显抑制survivin表达量及磷酸化，并且随着SB-273005浓度升高，其对survivin表达及磷酸化的抑制呈增高趋势。见图4，5，6。
2.3 Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数
Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数，以数据表显示。随SB-273005处理浓度的增加，talin、survivin蛋白的表达量及磷酸化水平明显下降，与对照组比较，差异有统计学意义（*P＜0.05）；与SB-273005低浓度组比较，差异有统计学意义（△P＜0.05），见表1。
3 讨论
目前研究证实，整合素αvβ3参与多条信号通路的调控，通过与ECM配体结合，促成黏着斑复合物的形成[3]。同时，该复合物所包含的配体以及其他信号分子暴露其活化位点，通过与下游的染色质片段或蛋白相互作用[4]，产生相应的生物学效应。
该研究结果显示：各实验组通过加入不同浓度的αvβ3拮抗剂SB-273005均能明显降低C6细胞talin蛋白的表达，对其磷酸化有明显的抑制作用。测得对照组、SB-273005低浓度组和SB-273005高浓度组磷酸化的talin/β-actin的平均光密度比值分别为0.82、0.33、0.15（*P<0.05)。3组相比，差异有统计学意义。国内外学者同样证实，talin蛋白的磷酸化主要通过C-端区上的序列发挥作用，且多在细胞粘附之前，就已完成多个酪氨酸位点的磷酸化。其中，最重要的自主磷酸化部位Tyr397在这一过程中起至关重要的作用[5]。这与实验中，磷酸化的talin的检测结果相符。并提示talin有可能是整合素黏着斑形成初期所依赖的基础分子，多个磷酸化位点为后期整合素相关信号通路激活发挥重要作用[6]。
目前认为，整合素激活talin的可能模式是：整合素αvβ3受到信号刺激后，整合素-talin相互作用，使多个talin分子相互磷酸化而被激活。并通过对下游信号转导分子的激活，对多条信号转导通路予以调控，从而发挥相应生物学效应。
与talin蛋白不同，Survivin蛋白在多个肿瘤细胞中，与P53、bcl 2蛋白存在相关性。该研究结果显示：加入各实验组不同浓度的SB-273005均能明显降低C6细胞survivin蛋白的表达，对二者的磷酸化有明显的抑制作用。3组相比，差异有统计学意义。国内已经有研究证实，Survivin蛋白可以通过结合caspase家族蛋白形成的DISC和细胞色素C分别激活内源性与外源性两条通路调控细胞的凋亡[7]。Survivin可以通过调控caspase-3 的活性导致核糖体的磷酸化，而后者可以使细胞进入周期，减少凋亡[8]。虽然三者在胶质瘤细胞的增殖和侵袭性生长等恶性生物学方面均起重要调节作用。但其具体的作用机制并不清楚。在肿瘤微环境的条件下，哪一种机制是起主导作用的，还有待进一步研究。
综上，该研究表明整合素αvβ3拮抗剂SB-273005能有效地抑制talin、survivin表达量及其磷酸化程度，且均呈剂量依赖性抑制作用，为脑胶质瘤细胞的生物学研究提供依据，为后期中枢神经系统恶性肿瘤的治疗提供新的方法。
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参考文献
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（收稿日期：2014-08-27）