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结核病血清诊断中HSP65的应用前景分析

  • 投稿Leo
  • 更新时间2015-09-15
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孙丽娜1 孙京涛2  田永全3

1.廊坊市疾病预防控制中心 ,河北廊坊 065000;2.廊坊市人民医院,河北廊坊 065000;3.廊坊市食品工程学校,河北廊坊 065000

摘要]目的 通过评价HSP65抗原表达在结核病血清诊断中的效果,分析其应用前景。方法 取活动期结核病患者63例纳入观察组,选取体检健康志愿者60例纳入对照组,就HSP65分别与38kDa、16kDa、LAM联合检测诊断对照组与观察组结核病。结果 Western-blot结果显示,表达产物在相对分子量65kμ处有一条表达带,在健康人血清阴性中则无表达带;特异度、敏感度与38kPa基本一致,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HSP65在结核病血清诊断中可作为备选标志物,反应强度与38kDa基本相当,联合诊断有助于提高诊断符合率;HSP65对结核病X线空洞影敏感度较高。

[教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ]结核病;结核分歧杆菌;血清学;HSP65

[中图分类号]R69[文献标识码]A[文章编号]1674-0742(2015)04(a)-0010-002

[作者简介]孙丽娜(1978.7-),河北廊坊人,本科,主管技师,研究方向:检验。

结核病(tuberculosis,TB)是一种结核分枝杆菌感染引起的传染病,全世界每年约有20亿人感染结核分枝杆菌(M.tuberculosis,MTB),我国TB发生率、发病率、病死例均位于世界前列,TB防控形势仍不容乐观[1-2]。MTB潜伏性是致TB防控效果不佳的主要原因之一,感染者早期常无典型症状表现,且难以根除,无症状携带者对MTB抗原产生迟发型超敏反应(DTH)是潜伏期诊断的唯一指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2013年2月—2014年5月该医院收治的所有活动期结核患者作为研究对象。纳入标准:①临床确诊,活动期患者;②知情同意;③临床资料完整。入选患者63例纳入观察组,其中男33例、女30例,年龄27~64岁,平均(44±14)岁,病程1~8年,平均(1.5±3.2)年,抗酸染色阳性43例、痰细菌培养阳性52例、PPD皮试阳性35例,X线片结核空洞影46例。选取体检健康志愿者60例纳入对照组,其中男31例、女29例,年龄28~64岁,平均(45±12)岁,未合并有肺部疾病,如肺结核、肺炎,两组患者年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 材料与试剂

E.coli DH5α、MTB H37Rv株,pPRO EX HTa原核表达载体,GCG疫苗株,Takara公司提供。LA Taq DNA聚合酶、Ecor I试剂Takara公司提供,T4连接酶、质粒DNA小量提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司产),DNA快速纯化/回收试剂盒,标准蛋白分子量、HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗人IgG,鼠抗MTB HSP65 mAb等。仪器主要包括:TGL.16G高速台式离心机,HERAEYS CO2培养箱,法VILBER LOURMAT公司产VILBER凝胶成像仪,SPECORD 40紫外分光光度仪,-70℃超低温冰箱,倒置显微镜,生物安全台,医用净化工作台,Dy-3D 型多功能电泳仪,紧密电子天平,Olymbus公司荧光显微镜,SUN公司酶联免疫吸附仪等。

1.3 方法

制备E.coli DH 5α感受态细胞。参照GenBank组织标准MTB HSP65编码,设计引物,由北京奥科生物技术有限公司提供。扩增HSP65基因,扩增产物行DNA快速纯化回收。回收产物与克隆载体,将混合物以热休克法转化为E.coli DH5α感受态细胞,观察白色菌落。进行重组质离酶切鉴定、序列测定,阳性克隆名为pPRO-hsp65,进行鉴定,取鉴定正确的阳性菌行IPTG诱导,诱导后行SDS-PAGE凝胶电泳分析。以Ni-NTA纯化试剂盒纯化蛋白,离心100 mL诱导菌液,制备样品,进行亲和色谱纯化,收集洗脱液,以紫外分光光度仪测定纯化蛋白浓度,将洗脱液以置于-20℃恒温冰箱保存备用。

表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后,100V恒压电转1h行蛋白电转,后转至硝酸纤维素膜上、行丽春红染色,若蛋白电转成功,以蒸馏水洗至褪色,以10g/L牛血清白蛋白TBST封闭30min,连续震荡洗涤3×5min,分别以鼠抗MTB HSP 65mAb、观察组患者血清、对照组健康人血清结合1h,TBST震荡洗涤3×5min,加HRP标记羊抗鼠IgG结合1h,TBST震荡洗涤3×5min,以OPD显色液观察结果。同时,联合目前临床已相对成熟的38kDa、16kDa、LAM抗原血清学应答辅助诊断,将观察组与对照组患者血清编号打乱,观察组作为“真阳性”、对照组为“假阳性”,则敏感度=观察组中检查出的阳性例数/真阳性例,特异度=观察组中检查出阴性例数/真阴性例。

1.4 统计方法

数据以spss13.0软件处理,计数资料以[n(%)]表示,组间比较采用c2检验,。

2 结果

2.1 不同抗原表达血清诊断

Western-blot结果显示,表达产物在相对分子量65kμ处有一条表达带。HSP65分别与38kDa、16kDa、LAM联合检测,敏感度、特异度均有不同程度提高,其中与38kDa联合检测敏感度、特异度最高,HSP65+38kDa敏感度高于HSP65,HSP65特异度高于16kDa,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1

2.2 抗酸染色、PPD皮试与X线片对HSP65检测影响

HSP65血清抗原检测正确者X线片结核空洞影比重高于错误者,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

3 讨论

该次实验以Ppro EX HTa表达为载体,行酶切位,高效转录Trc启动子,以表达HSP65基因,有利于蛋白的分离纯化,且表达较稳定,蛋白生物学活性保留较好[4-5]。分离纯化HSP65,行血清学检测结果,显示敏感度达68.75%、特异度达86.67%,高于LAM、16kDa,与38kDa基本持平,后三者均为目前临床常用的MTB感染血清学诊断标志物,提示HSP65可作为血清学诊断TB单独标志物。此外,HSP65+38kDa敏感度高于HSP65,HSP65特异度高于16kDa,差异有统计学意义(P<0.05),提示联合检测可能提高检测敏感度,但无法有效提高特异度。关于LAM、16kDa、38kDa血清学诊断肺结核研究较少,敏感度在40%~90%之间,如林楠等以4种结核抗原进行结核病血清学诊断,单独应用灵敏度在30.9%~66%,特异度76.2%~90.5%[2-3,6],不同学者研究结果存在较大差异,这与不同患者肺结核严重程度、结核分枝杆菌活动度存在较大差异纳入患者标准不统一有关,血清学检测运用于结核病诊断敏感度仍较低,大规模推广尚需时日。

该次研究表明,HSP65诊断正确者抗酸染色阳性比重、PPD皮试阳性比重差异无统计学意义(P>0.05),提示抗酸染色阳性比重、PPD皮试阳性不能真实反映MTB应激状态。HSP65血清抗原检测正确者X线片结核空洞影比重高于错误者,差异有统计学意义(P<0.05),提示X线片空洞形成与MTB应激有关,提示患者病情已进入或将要进入活动期。刘志辉等对结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌培养滤液、胸腔积液和血清蛋白质组进行分析,结果显示滤液、胸液与血清特异性蛋白质标志物密切相关,而滤液、胸腔积液与空洞形成有关[7]。目前,已有血清学快速诊断肺结核技术,孟炜丽等以血清腺苷脱氨酶诊断肺结核敏感度达94.0%、特异性70.7%,具有较高的应用价值,HSP65在结核病血清诊断中的应用仍有待时日[8]。

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参考文献]

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[2]王芸,许琳.云南省2000、2010年结核病流行病学抽样调查分析[J].预防医学论坛,2014,20(1):11-19.

[3]魏巍,覃林珍,刘守江,等.实时荧光聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA诊断肺结核价值[J].临床荟萃,2014,29(6):611-613.

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[7]刘志辉,彭德虎,孟繁荣,等.结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌培养滤液、胸腔积液和血清蛋白质组分析[J].实用医学杂志,2014,30(17):2745-2746.

[8]孟炜丽,朱丹红,李清,等.血清腺苷脱氨酶测定在涂阴肺结核诊疗中的应用价值[J].临东荟萃,2014(11):1228-1232.

(收稿日期:2014-12-28)