摘 要：目的 探究帕金森病(Parkinson’s disease,PD)致病基因DJ-1致病突变A39S以及DJ-1的SUMO化修饰对DJ-1蛋白在线粒体亚细胞定位的影响。方法 构建可稳定表达野生型、A39S突变型、K130R突变型及A39S-K130R双突变型DJ-1蛋白及SUMO-1蛋白的COS-7细胞系。再通过Western印记、激光共聚焦及免疫荧光技术观察DJ-1蛋白表达情况及亚细胞定位,免疫荧光共定位观察DJ-1和SUMO-1是否存在相互作用。结果 免疫荧光表明DJ-1蛋白主要分布在细胞浆中,也存在于细胞核中,野生型和K103R型DJ-1蛋白部分分布在线粒体上,A39S及A39S-K130R突变型DJ-1蛋白大部分转移至线粒体上,SUMO-1主要分布于细胞核及核周,呈斑点状分布。免疫荧光共定位发现四种DJ-1蛋白均与SUMO-1蛋白存在共定位。结论 DJ-1致病突变A39S使DJ-1蛋白从胞浆转移至线粒体上; DJ-1与SUMO-1存在共定位,两者可能存在相互作用。
关键词：帕金森病 DJ-1 SUMO-1 A39S 线粒体
The effects mutant DJ-1 and sumoylation of DJ-1 protein on DJ-1 mitochondrial localization
LI Lizhi ZHOU Xiaolan TANG Beisha
Department of Neurology,Xiangya Hospital Central South University;
Abstract：
Objective To investigate the effects of DJ-1 A39S mutation in Parkinson's disease(PD) and SUMO modification of DJ-1 on DJ-1 mitochondrial localization.Methods Five COS-7 cell lines that can stably express wild-type,A39S mutant,K130R mutant,A39S-K130R double mutant DJ-1 protein and SUMO-1 protein were constructed.The transfection results were detected by Western blot,double enzyme digestion and PCR sequencing.The expression and subcellular localization of DJ-1 protein were observed by Western blotting,confocal microscope and immunofluorescence.Results Immunofluorescence showed that DJ-1 protein was mainly distributed in the cytoplasm and also in the nucleus.Some wild-type and K130R DJ-1 proteins were distributed in mitochondria,most of A39S and A39S-K130R mutant DJ-1 proteins were transferred to mitochondria,and SUMO-1 was mainly distributed in the nucleus and around the nucleus.Immunofluorescence co localization showed that four DJ-1 proteins were co-localize with SUMO-1 protein.Conclusion The pathogenic mutation A39S of DJ-1 transferred DJ-1 protein from cytoplasm to mitochondria; DJ-1 and SUMO-1 have co localization,and they may interact.
Keyword：
Parkinson's disease; DJ-1; SUMO-1; A39S; Mitochondria;
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种渐进性神经系统疾病，又称震颤麻痹(Paralysis agitans)，以静止性震颤、肌强直、动作迟缓和姿势平衡障碍为主要特征。帕金森病的发病机制目前尚不清楚，研究认为可能与线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性作用等有关[1～4]，且有研究发现PD有家族聚集现象，提示PD发病与遗传因素有关[5,6]。DJ-1是常染色体隐性遗传性帕金森病的致病基因[1]，该基因于2003年首次被发现与早发性帕金森综合征(autosomal recessive early-onset parkinsonism,AREP)有关[1]。临床上，带有DJ-1突变的帕金森患者表现为早发运动迟缓、肌强直和震颤，在疾病后期出现焦虑、认知障碍等精神症状，对左旋多巴治疗反应良好[1,7,8]。
人DJ-1基因定位于1p36.23，长23.86 kb，编码含189个氨基酸高度保守的DJ-1蛋白[1,7,9]。DJ-1蛋白在生理条件下形成二聚体，广泛表达于胰腺、肾脏、骨骼肌等组织，脑组织则在黑质、尾状核、丘脑等与PD相关区域表达水平较高[10]。DJ-1参与机体感知并预防氧化应激，其缺失会加重氧化应激、内质网应激诱导的细胞死亡[11,12]。DJ-1目前在PD发病机制中的作用尚未阐明，Bonifati等发现DJ-1致病突变L166P可改变DJ-1在细胞内的分布，将DJ-1定位到线粒体上，导致细胞功能障碍，从而参与致病过程[1]。
SUMO-1也称为PIC1(PML-interacting clone 1)，是一个101个氨基酸组成的多肽，与泛素具有低(18%)但显著的同源性。SUMO-1修饰，称为Sumoylation，与泛素化类似。在SUMO特异性蛋白酶与E1异二聚体酶、E2酶及E3酶共同参与下，经过成熟、活化、转移、连接、解离等过程完成SUMO化和去SUMO化，改变修饰蛋白的稳定性和细胞内定位[3,13,14]。SUMO-1底物蛋白多含有ΨKx E或者ΨKx D模块(Ψ代表疏水氨基酸，K代表赖氨酸，x代表任意氨基酸，E代表谷氨酸，D代表天冬氨酸)[14]。DJ-1蛋白含有ΨKx E模块，且已被证明为SUMO-1的底物。
目前已发现SUMO-1与DJ-1神经变性中发挥作用，我们在前期研究中发现DJ-1的A39S突变导致细胞内基因表达改变，如UGT2B7表达下调，可能与PD发病机制有关[15]，猜测SUMO-1和DJ-1 A39S可能参与PD发病[16,17]。本研究构建DJ-1致病突变质粒，探讨SUMO-1和sumoylation对DJ-1细胞内定位及PD发病机制的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
pc DNA3.1-hygro (-)-SUMO-1;p EGFP-N1 vector;pc DNA3.1-myc-DJ-1-WT,pc D-NA3.1-myc-DJ-1-A39S;p GEX-5x-1-DJ-1-K130R;PC-MV-Flag-2A;QIAGEN-tip-100,QIAprep Spin;EcoR I、Xho I、BgⅠⅡ、SalⅠ、Hind III、Bam H I核酸内切酶，T4 DNA连接酶，Pyrobest酶等;引物;COS-7细胞株;p EGFP-N1载体;ECL试剂盒;DMEM;胎牛血清;胰酶;EDTA;Lipofectamine 2000;GFP单克隆抗体;辣根过氧化物酶偶联的山羊抗鼠Ig G;Mito Tracker Deep Red 633;CY3-flag。
1.2 实验方法
1.2.1 野生型、A39S突变型、K130R突变型、A39S-K130R双突变DJ-1基因(p EGFP-N1-DJ-1-WT、p EGFP-N1-DJ-1-A39S、p EGFP-N1-DJ-1-K130R、p EGFP-N1-DJ-1-A39S-K130R)及SUMO-1基因(PC-MV-Flag-SUMO-1)融合表达载体的构建
设计引物，PCR扩增引物，扩增目的基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物并切胶回收。双酶切处理PCR纯化产物并进行测序验证，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物。制备感受态JM109细菌，将5种质粒分别转染JM109细菌，将细菌铺于固体LB培养皿过夜，挑选白色克隆，手工法抽质粒后采用双酶切及DNA测序验证目的片段是否成功表达。检测后，取验证后的阳性克隆菌液，培养提取质粒并保存。
1.2.2 激光共聚焦显微镜观察DJ-1-EGFP融合蛋白的表达与分布
将COS-7细胞用培养于37℃，5%CO2培养箱中。转染前一天，胰酶消化后接种在12孔板孔中继续培养。细胞生长至80%～90%汇合时即可开始脂质体转染。每孔转1.2μg质粒DNA,3μl Lipofectamine 2000。操作按照Lipofectamine 2000说明书进行。COS-7细胞转染表达载体后培养24 h,PBS洗一次，3.7%多聚甲醛固定后PBS洗3次。封片后用激光共聚焦显微镜断层扫描并照相，用波长488 nm的激光激发。
1.2.3 荧光倒置显微镜观察SUMO-1-Flag融合蛋白的表达与分布
接种、转染COS-7细胞同前，PBS洗3次;-20℃预冷甲醇固定10 min,PBS-T洗3次。加入0.2%Triton-PBS室温孵育10 min,PBS洗4次。加入5%BSA封闭液，室温封闭1 h。加入与CY3联合的抗Flag抗体(1∶250稀释在封闭液中)，室温孵育1 h,PBS洗5次，阴性对照不加抗体。加入1∶1000倍稀释的Hoechst33258(稀释在封闭液中)，室温孵育10 min。封片后在荧光显微镜下观察和照相。CY3经激发后发红色荧光，Hoechst33258经激发后发蓝色荧光。
1.2.4 Western Blot检测DJ-1-p EGFP-N1和SUMO-1-Flag融合蛋白的表达
培养、转染COS-7细胞，转染细胞24 h后，PBS洗3次，每孔加入60μl(按照12孔板进行) 2×loading buffer，孵育10 min，收集细胞裂解液。裂解液100℃水浴中变性10 min，冷却后上样跑胶。转膜封闭后加一抗，洗去一抗后加二抗，洗去二抗后按ECL试剂盒说明书进行电化学发光检测。
1.2.5 荧光染色分析技术检测突变DJ-1蛋白的细胞定位情况
配置Mito Tracker Deep Red 633，接种、转染COS-7细胞。COS-7细胞培养24 h后，加入37℃预热含有1.8μM Mito Tracker的培养基，在37℃，5%CO2培养箱中孵育40 min。染色后固定COS-7细胞，后用PBS洗3次，加入0.2%的PBS-T，室温孵育5 min，用PBS洗3次。封片后用激光共聚焦显微镜扫描和照相。用波长488 nm和637 nm的激光激发，GFP经激发后发绿色荧光，Mito Tracker经激发后发红色荧光，双色叠加后为黄色荧光，即共定位部分。
1.2.6 免疫荧光和激光共聚焦激光显微镜观
察SUMO-1-Flag和EGFP-DJ-1融合蛋白在细胞中的共定位情况接种、转染COS-7细胞，转染分为p EGFP-N1和p CMV-Flag空质粒共转组、p EGFP-N1空质粒和p CMV-Flag-SUMO-1共转组、p CMV-Flag空质粒和p EGFP-N1-DJ-1共转组及p EGFP-N1-DJ-1和p CMV-Flag-SUMO-1共转组4组。培养24 h后用PBS洗3次，然后加入-20℃预冷甲醇固定10 min，用PBS-T洗3次。加入0.2%Triton-PBS室温孵育10 min，然后用PBS洗4次。加入5%BSA封闭液室温封闭1 h。加入与CY3联合的抗Flag抗体(1∶250稀释在封闭液中)，室温孵育1 h，然后用PBS洗5次;阴性对照不加抗体。加入1∶1000倍稀释的Hoechst33258(稀释在封闭液中)，室温孵育1 h。封片后用激光共聚焦显微镜扫描和照相。用波长488 nm和637 nm的激光激发，GFP经激发后发绿色荧光，CY3经激发后发红色荧光，双色叠加后为黄色荧光，即共定位部分。
2 结果
2.1 稳定表达目的蛋白的COS-7细胞系的建立
经过转染和筛选后，建立了稳定表达野生型和A39S、K130R突变型、A39S-K130R双突变DJ-1蛋白及SUMO-1的COS-7细胞。经过测序、双酶切及琼脂糖凝胶电泳验证构建质粒序列正确。4种DJ-1表达质粒均能表达DJ-1与EGFP的融合蛋白，而SUMO-1表达质粒也可表达SUMO-1-Flag融合蛋白。
2.2 DJ-1-p EGFP-N1融合蛋白及SUMO-1-Flag融合蛋白的表达与分布
DJ-1蛋白广泛分布在细胞质和细胞核中，没有明显蛋白聚集物形成，野生型和各突变型相比无明显差别，转染p EGFP-N1载体的对照组细胞在胞质和胞核均有绿色荧光的表达。SUMO-1在细胞内位于细胞核内或核周的胞浆中，并且多以斑点状形式存在，且Flag空载体未见有红色荧光表达。
2.3 荧光染色分析技术检测突变DJ-1蛋白的细胞定位情况
野生型和K130R型DJ-1蛋白部分分布在线粒体上，A39S和A39S-K130RDJ-1蛋白分布在胞浆中的则大部分转移至线粒体上(见图1)。即DJ-1基因致病突变改变了DJ-1蛋白的亚细胞定位，而EGFP没有定位在线粒体上。
图1 正常和突变DJ-1蛋白的亚细胞定位结果(1000×)
绿色为EGFP或DJ-1-EGFP融合蛋白，红色为Mito Tracker染色，示线粒体，黄色信号为两种波长的荧光叠加所致，即共定位部分
2.4 免疫荧光和激光共聚焦激光显微镜观察
SUMO-1-Flag和EGFP-DJ-1融合蛋白在细胞中的共定位情况四种DJ-1-EGFP蛋白均能正常表达和分布，p CMV-Flag空载体未见SUMO-1有表达，p EGFP-N1空载体未表达DJ-1。四种DJ-1-EGFP蛋白均与SUMO-1-Flag蛋白存在共定位信号，EGFP与SUMO-1没有共定位，四种DJ-1-EGFP蛋白与p CMV-Flag也不存在共定位信号(见图2)。
图2 正常和突变DJ-1蛋白与SUMO-1的共定位结果(1000×)
绿色为正常和突变的DJ-1-EGFP融合蛋白，红色为SUMO-1-Flag融合蛋白，黄色信号为两种波长的荧光叠加所致，即共定位部分
3 讨论
帕金森病(PD)是第二常见的神经退行性疾病，大约10%的PD病例与遗传因素有关[18]。DJ-1基因是遗传性帕金森病致病基因之一，具有细胞周期调节、控制基因转录和抵抗氧化应激等生理功能，但其导致PD发病机制尚未明确。SUMO-1与泛素具有显著的同源性，但与泛素的生理功能不同，SUMO-1主要调控被修饰蛋白在细胞的分布、代谢及功能。DJ-1含有SUMO-1修饰底物-ΨKxE模块，已确定为SUMO-1的底物蛋白[14]，研究表明sumoylation修饰可以干扰线粒体动力学，可能在PD的发病中起到作用[18]。Bonifati等研究也发现了DJ-1另一突变L166P致病突变会导致DJ-1蛋白在细胞内的分布发生改变，从胞浆转移至线粒体上，导致DJ-1蛋白及线粒体功能障碍，导致PD的发生[1]。A39S与SUMO-1是否也会导致DJ-1蛋白亚细胞定位发生改变，引起DJ-1蛋白和线粒体功能障碍引起PD。
为了阐明DJ-1突变、DJ-1蛋白亚细胞定位、SU-MO-1在PD致病机制中所起的作用，本研究构建了pCMV-Flag-SUMO-1、pEGFP-N1-DJ-1-WT、p EGFP-N1-DJ-1-A39S、pEGFP-N1-DJ-1-K130R、pEGFP-N1-DJ-1-A39S-K130R五种真核表达质粒。免疫荧光结果发现四种DJ-1蛋白中野生型及K130R突变型仅少部分分布于线粒体上，而A39S突变型及A39S-K130R型蛋白分布则由胞浆转移至线粒体上，这表明DJ-1致病突变A39S及A39S-K130R突变改变了DJ-1蛋白在亚细胞结构的分布，并且主要转移至线粒体上，可能引起DJ-1蛋白的结构及功能改变及线粒体功能障碍[19～21]。免疫荧光共定位发现外源性过表达的SUMO-1蛋白及4种DJ-1蛋白均存在共定位信号，这表明DJ-1与SUMO-1之间可能存在相互作用。因此，SUMO-1与DJ-1之间的相互作用及A39S突变可能影响DJ-1在亚细胞水平上的分布，导致DJ-1转移至线粒体，影响DJ-1及线粒体功能，引起PD的发生。但这仅仅只是猜测，本研究并未确定DJ-1与SUMO-1之间存在相互作用，也无法确定该相互作用对DJ-1的影响，而DJ-1转移至线粒体上对DJ-1、线粒体及整个细胞的影响也尚未可知。
本研究虽然通过免疫荧光及激光共聚焦技术发现DJ-1致病突变A39S会导致DJ-1蛋白的亚细胞定位发生改变，且SUMO-1与DJ-1可能存在相互作用，但是本实验还是存在一些缺陷。首先，DJ-1蛋白转移至线粒体后对DJ-1蛋白结构功能及线粒体功能的影响未作进一步研究，而DJ-1蛋白与细胞内其它细胞器的关系也缺乏进一步的了解。其次，虽然通过免疫荧光共定位确定了SUMO-1与4种DJ-1蛋白之间都存在共定位信号，但是确定蛋白之间存在相互作用需要结合免疫荧光共定位及免疫共沉淀来验证，且DJ-1蛋白在胞浆及胞核内都广泛分布，SUMO-1分布于细胞核内及核周，可能存在假阳性结果，因此，需要进一步免疫共沉淀结果才能确定SUMO-1与DJ-1之间存在相互作用。
综上，本实验成功构建了能在哺乳动物细胞内表达SUMO-1、野生型、A39S突变型、K130R突变型及A39S-K130R双突变型DJ-1的真核表达质粒，在COS-1细胞内表达几种质粒，发现DJ-1与SUMO-1存在共定位信号，提示两者可能存在相互作用。最后，DJ-1致病突变A39S及A39S-K130R会使DJ-1蛋白从胞浆转移至线粒体，为发现PD的发病机制提供了研究基础。
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