摘 要：利用RT-PCR、间接免疫荧光实验、免疫印迹实验、抗体中和实验以及BiFC等方法对柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2同源分子—EtRON2L2的特性和功能进行研究。结果发现EtRON2L2 氨基酸序列与常规的EtRON2 仅有26.63% 的同源性，mRNA水平在第二代裂殖子中最高，而蛋白水平在第二代裂殖子和子孢子阶段最高；EtRON2L2在游离的第二代裂殖子和子孢子阶段主要分布于胞质，而在入侵后子孢子中主要分布于虫体表面；抗rEtRON2L2多克隆血清处理组明显抑制子孢子入侵细胞；EtRON2L2与EtAMA3之间存在互作关系。本研究为探究EtRON2L2在球虫入侵过程中的作用机制奠定基础。
关键词:柔嫩艾美耳球虫;棒状体颈部蛋白2;相互作用;
Characteristics and Biological Function of Rhoptry Neck Protein Ron2|2 of Eimeria Tenella
LIU Man-yu ZHU Shun-hai ZHAO Qi-ping JIA Liu-shu XIAO Ke ZHAO Huan-zhi YU Yu
HUANG Bing HAN Hong-yu DONG Hui
Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agricuture and Rural Afairs, Shanghai
Veterinary Research Institute,CAAS
Abstract：The molecular characteristics and biological function of rhoptry neck protein RON2L2 of Eimeria tenella (EtRON2L2) were studied by RT-PCR, indirect immunofluorescence assays, western-blot, antibody neutralization assay and BiFC assay. The results showed that the amino acid sequence of EtRON2L2 had 26.63% identity with EtRON2, the mRNA level of EtRON2L2 was the highest in the second-generation merozoites, while the translation level was higher in second-generation merozoites and sporozoites; EtRON2L2 was mainly distributed in the cytoplasm of free second-generation merozoites and sporozoites, while it is mainly distributed on the surface of the parasite after invading cells; the anti-rEtRON2L2 antibody has a significant inhibitory effect on the invasion of sporozoites; there is an interaction with Eimeria tenella apical membrane antigen 3 (EtAMA3). The results of this study lay a foundation for further research on the function and mechanism of EtRON2L2 in the invading process of Eimeria tenella.
Keyword：
Eimeria tenella; rhoptry neck protein 2; interaction;
顶复门原虫种类繁多，包括疟原虫（Plasmodium spp.）、弓形虫（Toxoplasma gondii）、巴贝斯虫（Babesia spp.）、艾美耳球虫（Eimeria spp.）及隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）等[1,2,3]，是人和动物的重要病原，对人类健康以及畜牧养殖业具有严重危害[4,5]。这类原虫在亚细胞结构上都有类锥体、极环、顶泡以及微线体、棒状体等，这些保守性结构共同形成顶端复合体[6,7]，对宿主细胞具有相对保守的入侵机制[8]。相关研究表明，顶复门原虫入侵细胞过程中，棒状体分泌的蛋白棒状体颈部蛋白2（Rhoptry neck protein 2，RON2）黏附并嵌入宿主细胞膜，与微线体分泌的顶膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）互作形成复合物（AMA1-RON2），分布于运动连接环（Moving junction，MJ），在虫体入侵细胞过程中发挥重要的功能[9,10,11,12,13]。。近年来的研究发现，弓形虫、艾美耳球虫、新孢子虫等艾美耳亚目原虫除了AMA1和RON2之外，还存在至少2个RON2同源分子（RON2L1、RON2L2）和3个AMA1同源分子（AMA2/3/4），它们之间相互作用形成AMA2-RON2、AMA3-RON2L2和AMA4-RON2L1复合物[10,11,13]，这些复合物的功能还不清楚。
柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的生活史主要包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖[10,14,15,16]。通过对柔嫩艾美耳球虫的子孢子棒状体和不同发育阶段虫体的蛋白质组学分析，发现了4个在特定发育阶段调控表达棒状体颈部蛋白2分子（EtRON2s），分别是在子孢子和第二代裂殖子阶段调控的EtRON2、在子孢子阶段调控的EtRON2L1-1和EtRON2L2和可能裂殖子阶段调控的EtRON2L1-2[10,17,18,19,20]。Parker等[21]通过进化树发现柔嫩艾美耳球虫具有3个RON2同源分子（EtRON2L1-1、EtRON2L1-2、EtRON2L2），并预测了EtRON2L2与EtAMA3互作。余水兰[22]发现 EtRON2在子孢子和裂殖子中均定位在虫体顶端棒状体位置，抗rEtRON2多克隆血清明显能够抑制子孢子入侵宿主细胞。Han 等[23]筛选出EtRON2可能与EtAMA1存在互作；严茗、王青杰等[10,15]利用双分子荧光互补实验（BiFC）对该潜在互作关系进行了验证，结果发现EtRON2确实可以与 EtAMA1发生互作。目前对EtRON2s 的探究主要集中在EtRON2上，而缺乏对其他RON2同源分子的研究[10]。本文对EtRON2L2的特性与功能进行了初步研究，并通过间接免疫荧光技术验证EtRON2L2与EtAMA3存在相互作用。
1 材料与方法
1.1细胞、质粒、虫株
鸡成纤维细胞（DF-1）、原核表达载体pCold I、真核表达质粒pBiFC-VC155和pBiFC-VN155-EtAMA3、柔嫩艾美耳球虫上海株（资源编号：CAAS21111611）由中国农业科学院上海兽医研究所动物原虫病创新团队保存。
1.2试剂
感受态细胞TOP10、BL21（DE3）购自上海TIANGEN公司；限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ 购自NEW ENGLAND BioLabs（北京）；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司；ClonExpress® II One Step Cloning Kit购自Vazyme生物科技股份有限公司；BCA试剂盒、Protein A+G Agarose 购自于碧云天公司；FuGENE HD® 购自普洛麦格（北京）公司。
1.3 孢子化卵囊总RNA的提取及其cDNA模板的制备
参照王青杰等[24,25]方法纯化卵囊，取2×107个纯化后的孢子化卵囊，加入1 mL TRIzol和等卵囊体积玻璃珠，振荡至卵囊破壁率达90% 以上，提取总RNA；通过1% 琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，并用紫外分光光度计测浓度及纯度；最后，通过SuperScript III RT 试剂盒进行反转录得到第一链cDNA，用作扩增模板。
1.4 EtRON2L2基因的克隆与序列分析
通过诺唯赞引物设计网址（http://crm.vazyme.com.https.gzlib.proxy.chaoxing.com/cetool/singlefragment.html）设计EtRON2L2（ToxoDB登录号：ETH_00028240）的基因编码区序列（1935 bp）的引物，F：5'-CTCGGTACCCTCGAGGGATCCATGCCGACTGCTATTCTCTCGCTG-3'，R：5'-CTATCTAGACTGCAGGTCGACTTATTGACCACCATCAGCTTTCAATT-3'，（酶切位点BamH Ⅰ 、Sal I用下划线标注）。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。使用ClonExpress® II One Step Cloning Kit将目的片段克隆至pCold I表达载体并转化至TOP10感受态细胞中，PCR鉴定后进行测序。将测序正确的EtRON2L2进行序列相似性分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）[10,26]。
1.5 重组EtRON2L2蛋白的表达与纯化
将测序正确的重组质粒转化到BL21（DE3），通过 IPTG诱导rEtRON2L2表达，将菌液超声后通过SDS-PAGE分析rEtRON2L2的表达及表达形式。将得到的重组包涵体蛋白切胶纯化，纯化方法参考张露[27]，测定浓度后保存于- 80 ℃冰箱备用。
1.6 重组EtRON2L2蛋白反应原性分析
纯化后的rEtRON2L2经聚丙烯凝胶电泳分析并转膜，5% 脱脂奶粉室温孵育2 h，PBS洗2次；加入兔抗第二代裂殖子全蛋白多克隆抗体（1 : 100），室温孵育2 h，PBST洗6次；加入HRP-山羊抗家兔IgG（1 : 5000），室温孵育45 min，PBST洗6次；加入显影液，通过蛋白电泳免疫印迹系统呈像。
1.7 重组EtRON2L2蛋白多克隆抗体的制备
用BCA法测定纯化后的EtRON2L2重组蛋白浓度[28]，兔子和小鼠接种量分别是200 μg/只和50 μg/只。将rEtRON2L2与佐剂按照相同体积在振荡乳化仪中乳化，通过皮下注射方式进行免疫。首次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，加强免疫佐剂为弗氏不完全佐剂[29]。
1.8 EtRON2L2蛋白在不同发育阶段虫体中的分布
子孢子分别在PBS缓冲液和完全培养基（CM）、第二代裂殖子在PBS缓冲液中孵育2 h。将鸡成纤维细胞（DF-1）分置于六孔板中（2×105/孔），待细胞长至80%左右加入子孢子（6×105个/孔），之后于入侵后不同时间进行间接免疫荧光处理，分别进行固定、通透、封闭后，加入兔抗EtRON2L2多克隆抗体（1 : 200），室温孵育2 h；PBST洗5次，加入荧光素FITC标记抗体（1 : 500），室温避光孵育45 min；PBST洗5次，加入DAPI（1 : 500）室温孵育20 min；PBST洗6次，滴加抗荧光淬灭剂，于荧光显微镜下观察。
1.9 EtRON2L2在虫体4个阶段转录水平检测
提取虫体4个阶段总RNA、去除基因组DNA、纯化各阶段总RNA、反转录为cDNA第一链[10,30,31]。以纯化后cDNA作为模板、柔嫩艾美耳球虫18S rRNA作为内参基因[32]，18S rRNA的上游引物为：5'-TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3'，下游为：5'-CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3'。EtRON2L2基因的上游引物为：5'-ACCAAGTCCAAAGAGACCTTCTACAAG-3'，下游为：5'-CGAACAATAAACTCCGCCTGAAAGC-3'。使用7500 RT-PCR系统进行扩增，用ΔΔCt法进行数据分析。
1.10 EtRON2L2在虫体4个阶段翻译水平检测
用RIPA蛋白裂解液裂解提取虫体4个阶段蛋白，BCA法测定蛋白的浓度[26]。将提取的4个阶段虫体蛋白进行10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉室温孵育1 h；PBS洗3次，加入 rEtRON2L2兔多克隆抗体（1 : 100）和鼠源抗α-Tublin单克隆抗体（内参，1 : 1000）室温孵育2 h；PBST洗5次，加入酶标二抗（1 : 5000）室温避光孵育45 min，PBST洗5次，显影液处理后用ChemiDocTMTouch Imaging System成像仪器呈像。
1.11 EtRON2L2多克隆抗体对子孢子入侵能力的影响
将 DF-1 细胞分置于 24 孔板中（3×105个/孔），待细胞长至80% 左右进行子孢子入侵实验[10,26]。采用CFSE试剂标记新鲜纯化的子孢子，用DMEM（含有 5% FBS和浓度为500 U/mL 青霉素/ 链霉素）悬浮标记后的子孢子，已纯化的不同浓度抗rEtRON2L2 IgG，终浓度分别为50、100、200、300、400 μg/mL，37 ℃ 共孵育 2 h，离心并弃去上清，用DMEM培养基（含有2%FBS和5%双抗）重悬子孢子，然后入侵DF-1细胞，于细胞培养箱中培养7 h后用流式细胞仪检测子孢子的入侵率[26,31]。阴性对照是相同浓度的兔IgG组，阳性对照是不加任何IgG的子孢子组，共进行3次试验[10]。根据各组的入侵率，计算出入侵抑制率，入侵抑制率=（1-rEtRON2L2抗体组或阴性对照组的入侵率/阳性对照组入侵率）×100%。
1.12 BiFC验证EtRON2L2和EtAMA3之间互作关系
1.12.1 真核重组质粒的构建
通过PCR从孢子化卵囊cDNA中扩增EtRON2L2基因，上游引物为：5'- TGGCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGCCGACTGCTATTCTCTCGCTG-3'，下游引物为：5'-AGATCTCGGTCGACCGAATTCTTGACCACCATCAGCTTTCAATT-3'（酶切位点EcoR Ⅰ 用下划线标注）。将测序正确的目的基因片段与酶切后的pBiFC-VC155真核质粒（EcoR Ⅰ）进行连接并转化至TOP10细胞中，PCR鉴定后送测序，将所构建的真核重组质粒命名为pBiFC-VC155-EtRON2L2。
1.12.2 转染
将BHK细胞分置于六 孔板中（4.5×105个/孔），待细胞长至80%。取出六孔板更换为opti-MEM培养基，按照FuGENE HD转染试剂说明书，将pBiFC-VC155-EtRON2L2 和前期已构好的pBiFC-VN155-EtAMA3重组质粒分别转染BHK细胞（质粒 : 转染试剂=1 : 4），24 - 48 h取出，通过间接免疫荧光（IFA）检测EtRON2L2和EtAMA3在细胞中的表达情况[33]。确认单质粒转染可成功表达后，进行共转染：将pBiFC-VC155-EtRON2L2 和pBiFC-VN155-EtAMA3共转染，为样品组；阴性对照组为pBiFC-bFosVC155和pBiFC-bFos（deltaZIP）VC155共转染；阳性对照组为pBiFC-bJunVN155（I152L）和 pBiFC-bFosVC155共转染；，参照严茗[15]方法进行。转染24 - 48 h于荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 EtRON2L2基因的克隆与鉴定
利用PCR扩增EtRON2L2基因，成功获得了预期的1935 bp产物（图1），cDNA的序列分析发现，该蛋白有644个氨基酸，蛋白分子量约为71 kDa，等电点为6.05，无信号肽和跨膜结构域。核酸序列比对发现其与EtRON2L2 Houghton株（GenBank登录号：XM_013380332.1）有99.8% 的同源性。蛋白质序列比对发现所获得的EtRON2L2 与柔嫩艾美耳球虫 RON2（登录号：XP_013231132.1）的同源性为26.63%（覆盖率为26%），而与EtRON2L2（登录号：XP_013233904.1）、TgRON2L2 （登录号：XP_018636309.1）、NcRON2L2（登录号：XP_003880969.1）的同源性分别为 100%（覆盖率为：100%）、35.68%（覆盖率为：45%）、41.67%（覆盖率为：38%）。
2.2 重组蛋白EtRON2L2的表达与纯化
将EtRON2L2连接至pCold I载体后诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，在72 kDa有条带，大小与预期的71.8 kDa（包含0.84 kDa 6×His标签蛋白）相符合（图2A），且在沉淀中表达，纯化后可获得较纯的rEtRON2L2（图2B）。
2.3 重组蛋白EtRON2L2的反应原性分析
Western blot结果显示，兔抗第二代裂殖子全蛋白血清处理后在72 kDa处有特异性条带，大小与预期的71.8 kDa一致（图3），反应原性良好，可以用于后续多克隆抗体的收集。
2.4 EtRON2L2蛋白在虫体的分布
IFA结果显示，当子孢子孵育在PBS中时，蛋白主要定位于胞质和表面（除折光体之外）（图4A）；而完全培养基孵育后，该蛋白在虫体顶端的表达量明显增多（图4B）；在子孢子入侵DF-1细胞2 h后，该蛋白在虫体表面的表达量明显增多（图4C）；而在滋养体和第一代裂殖体阶段，荧光信号不强（图4D、E）。在第二代裂殖子中，该蛋白分布于整个胞质，且荧光强度较强（图4F）。
2.5 EtRON2L2基因的转录水平分析
以管家基因18S rRNA作为实验内参，检测了EtRON2L2在柔嫩艾美耳球虫4个发育阶段中的mRNA转录水平。结果发现，该基因的转录水平在第二代裂殖子（Mrz）中最高，其次是为子孢子（Spz）和孢子化卵囊（SO），而在未孢子化卵囊（UO）中最低（图5）。
2.6 EtRON2L2基因的翻译水平分析
以柔嫩艾美耳球虫管家基因α-Tubulin作为实验内参，检测蛋白在柔嫩艾美耳球虫4个发育阶段中的翻译水平[35]。结果发现，该蛋白在4个阶段中的水平存在明显差异：在第二代裂殖子和子孢子中表达量高，而在未孢子化和孢子化卵囊中表达量低（图6）。
2.7 兔抗rEtRON2L2多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的影响
结果显示（图7），与正常的兔IgG相比，50 μg/mL抗rEtRON2L2处理对子孢子入侵能力无显著性影响（p > 0.05），而100、200、300、400 μg/mL抗rEtRON2L2处理均能明显降低子孢子入侵能力（p < 0.05），但100 - 400 μg/mL之间的抑制率无显著性差异。
2.8 真核重组质粒的构建
BiFC中所用到的pBiFC-VN155-EtAMA3重组质粒已于前期构建完成，我们通过PCR扩增EtRON2L2胞外区序列，获得目的条带1935 bp，将PCR扩增出来的胞外区克隆至pBiFC-VN155，成功构建了真核表达质粒pBiFC-VN155-EtRON2L2。使用小提质粒试剂盒提取重组质粒，并进行酶切鉴定。结果显示有两条带，表明真核重组质粒pBiFC-VC155-EtRON2L2构建成功。
2.9 BiFC验证潜在互作蛋白
将构建好的真核重组质粒pBiFC-VC155-EtRON2L2和pBiFC-VN155-EtAMA3分别转染BHK细胞，48 h后通过间接免疫荧光技术处理，于荧光显微镜下观察。结果显示重组质粒均能在细胞中成功表达（图9）。进行质粒共转染，结果发现，阳性对照共转染有绿色荧光，阴性对照共转染组无荧光反应，实验组pBiFC-VC155-EtRON2L2与pBiFC-VN155-EtAMA3共转染有绿色荧光（图10），说明EtRON2L2与EtAMA3存在互作关系。
3 讨论
目前鸡球虫病的耐药性已成为普遍的问题，且球虫疫苗由于弱毒返强、稳定性差等原因，在使用中也受到了限制，因此，筛选疫苗候选分子、研制新型有效疫苗迫在眉睫[10]。RON2蛋白质家族在顶复门原虫入侵宿主、毒力作用及纳虫空泡修饰等方面有着重要的意义，被视为有潜力的疫苗候选抗原[37]。本研究中，我们对EtRON2L2蛋白序列进行了分析，结果表明EtRON2L2与EtRON2类似，都不是跨膜蛋白，但两者氨基酸序列的同源性仅为26.63%，猜测这两个蛋白的特性可能有所不同。
经对不同发育阶段中EtRON2L2蛋白水平检测发现，EtRON2L2蛋白主要在裂殖子和子孢子中表达，说明该蛋白是裂殖子和子孢子阶段调控的，这与Lal[19]等和Oakes[20]等发现不太一致，这可能与检测方法、样品等不同有关系。经对虫体不同发育阶段中EtRON2L2的mRNA水平检测，发现其在第二代裂殖子中转录水平最高，这与翻译水平的结果不太一致，可能是RT-PCR 对检测 mRNA 具有非常高的灵敏度，理论上，只能检测到目标基因的一个拷贝。另外，基因在转录和翻译过程中的地点和时间不同[38,39]，这也可能是EtRON2L2的转录和翻译水平不一致的主要原因[40]。
定位结果发现，EtRON2L2在PBS孵育的子孢子中主要分布在胞质，而在CM孵育后和入侵2 h后的子孢子中主要分布在顶端和表面，说明该蛋白可能与子孢子入侵细胞相关。同时也发现，EtRON2L2在第一代裂殖生殖过程中的表达量很低，而在第二代裂殖子表达量较高，其在第二代裂殖生殖过程可能发挥了重要作用，这与Western blot结果一致。入侵实验结果发现，rEtRON2L2抗体对子孢子入侵DF-1细胞有明显的抑制作用。
已有研究发现，RON2蛋白质家族（RON2s）是顶复门原虫入侵宿主细胞的关键蛋白，其发挥作用的机制是RON2s能与相应的顶膜抗原分子（AMAs）发生互作形成RON2s- AMAs复合物，共同组成运动连接环（MJ）[10]。Parker等[41]预测柔嫩艾美耳球虫有4种RON2s，并与相应EtAMAs互作形成复合物，其中EtRON2L2与EtAMA3发生互作，本文对该预测进行了验证。研究蛋白-蛋白相互作用的技术有很多，常见的有Co-IP技术、Pull-down技术、酵母双杂交技术、BiFC技术等[42,43,44,45]。其中BiFC最大的一个优点在于其可视化，不需要底物及辅助因子，通过荧光显微镜及常规仪器可以之间的观测到结果[46,47]。该法已被广泛用于蛋白互作研究中，例如贾静等[48]运用BiFC技术检测Skp2与Cullin-1蛋白的相互作用；彭也等[49]基于BiFC技术验证了IMM-H004对CKLF1/CCR4结合的影响；庄淼等[50]应用BiFC技术验证了米曲霉Fus3与Ste12之间的蛋白互作。所以，本文选用BiFC来验证EtRON2L2与EtAMA3之间的互作关系，结果发现EtRON2L2可以与EtAMA3发生互作。因此，我们认为EtRON2L2与EtAMA3 形成复合物，在球虫入侵细胞发挥重要的作用，但EtRON2L2在柔嫩艾美耳球虫感染中的功能及作用机制仍需深入研究。
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