摘 要：目前药物治疗侵袭性真菌感染受其严重的毒副作用及耐药性菌株等挑战，故研发安全、高效的新型抗真菌药物对于解决现状具有重要意义。本文从侵袭性真菌作用靶点着手，在小分子物质和次生代谢产物等方面挖掘涉及真菌生物膜、细胞壁、关键代谢酶及线粒体等作用靶点及其机制，以期为防治侵袭性真菌的新药研发提供借鉴。
关键词：侵袭性真菌 靶点 小分子抑制剂 分子机制
Research progress on novel molecules and new targets for the control of invasive fungi
GUO Xi LAI Xin-xiu YANG Mei-yan LI Qiao-zhen WANG Si-hang SONG Zhang-yong
Department of Pathogenic Biology, School of Basic Medical sciences, South-west Medical University;
Abstract：At present, the drug treatment for invasive fungal infection is challenged by serious adverse effects and drug resistance. Therefore, the research and development of safe and effective new antifungal drugs is a great importance to support the clinical treatment of invasive fungal diseases. This article reviewed new targets of invasive fungi, and explores the underlying mechanisms of fungal biofilm formation, cell wall, key metabolic enzymes, mitochondria in the aspects of small molecule inhibitors and secondary metabolites, which may provide reference for the research and development of new drugs.
Keyword：invasive fungi; target; small molecule inhibitors; molecular mechanism;
广谱抗生素使用、免疫抑制剂滥用、艾滋病感染及血液系统恶性肿瘤等因素，造成以白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)为代表的侵袭性真菌感染率和致死率日益增长，严重威胁着人类健康。但现有抗真菌药物种类少、毒副作用强以及临床耐药甚至超级耐药菌株的涌现，均使得现有的抗真菌药物治疗受到挑战。
真菌细胞和哺乳动物细胞具有相似的真核生物特征，故药物新靶点探究核心是提高侵袭性真菌药物靶点的特异性，减少毒副作用[1-2]。在现代生命科学技术发展和对侵袭性真菌致病机制逐步深入的研究背景下，本文拟探讨小分子物质和次生代谢产物等对真菌生物膜、细胞壁、线粒体及生化代谢等相关靶点作用机制，总结出靶向治疗侵袭性真菌的潜在功能药物。
1 临床现有药物靶点
目前临床常用药物靶点主要有3类：1)合成的广谱抗真菌唑类药物抑制14α-羊毛脂醇脱甲基酶阻止麦角甾醇的合成；2)棘白菌素类药物非竞争性抑制β-1,3-葡聚糖合成酶，干扰细胞壁β-1,3-葡萄糖的合成；3)细菌次生代谢产物多烯类药物(如两性霉素B)与麦角固醇结合，改变细胞膜通透性，引起细胞内物质外渗。但部分临床真菌的天然耐药性、药物靶点基因突变造成的唑类耐药菌株、棘白菌素类受限的给药方式、多烯类毒副作用大等因素使得这3类药物的临床应用受到挑战。
2 生物膜及菌丝形成靶点
2.1 靶向生物膜及菌丝形成的物质
生物膜是指真菌黏附于惰性或活性实体的接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等物质，将其自身包绕其中而形成的大量真菌聚集膜样物。生物膜的形成是侵袭性真菌反复感染、慢性持续感染、产生耐药性的重要原因，其主要组成为菌丝。针对生物膜和菌丝形成的靶点药物开发是新药研发的重要方向。
2.1.1 影响信号通路调控生物膜形成的物质：
某些物质通过调控信号通路影响侵袭性真菌生物膜和菌丝的形成进而发挥抗真菌作用。例如大黄素是蛋白激酶CK2的天然抑制剂，通过抑制白色念珠菌菌丝发育及生物膜形成发挥作用，但对成熟的生物膜作用较弱[3]。粉防己碱以剂量依赖方式对白色念珠菌的酵母-菌丝形态转变和生物膜形成起抑制作用，这与调控Ras1p-cAMP-PKA通路基因表达下调有关[4]。
2.1.2 影响菌丝形成基因表达的物质：
基于具有良好的空间分散性、成药性能以及药物代谢动力学性质的小分子物质更易衍生出性质优良的抗真菌药物，部分小分子物质可针对菌丝形成基因发挥抗真菌作用。BH3I-1及其衍生物作用于白色念珠菌菌丝增殖特异基因RFG1、NRG1和UME6,抑制白色念珠菌菌丝的增殖与形态发生[5];具有抗菌和抗癌作用的糖脂生物表面活性剂-槐糖脂可下调念珠菌菌丝特异基因HWP1、ALS1、ALS3、ECE1和SAP4的表达，并阻止真菌黏附从而抑制生物膜形成[6]。
2.1.3 影响真菌附着与致病的物质：
“Filastatin”是一种对白色念珠菌附着至非活性表面(如聚苯乙烯塑料)和致病过程有显著抑制作用的化合物，对人体细胞系无毒，但其抑菌机制尚未明确。因此，“Filastatin”可作为潜在的保护性材料应用于医疗器械表面预防真菌感染[7]。与“Filastatin”有类似功能的防腐剂葡萄糖酸氯己定，对生物膜的抑制作用体现在改变细胞渗透性引起微生物溶解和抑制接触面的黏附[8]。
2.2 细菌代谢产物靶向生物膜及菌丝形成抑制物
细菌与真菌往往有着共同的寄生环境，两者相互影响。益生菌对白色念珠菌的抑制作用是依靠其代谢物的消旋来影响白色念珠菌在宿主表面定植和菌丝形成。如乳酸杆菌的培养上清液中发现的一些蛋白质分子、过氧化氢及低分子化合物(抑菌素、羧酸、脂肪酸)等代谢物，可抑制白色念珠菌酵母-菌丝的转变以及黏附[9]。卷曲乳酸杆菌的上清液中也发现可显著下调菌丝特异基因ALS3、HWP1、ECE1表达和上调负转录调节基因NRG1的功能物质[10]。
除益生菌外，包括芽孢杆菌在内的土壤细菌，除有效阻断新生隐球菌的关键毒力因子——黑色素和荚膜合成外，也对真菌生物膜形成及菌丝增殖有显著的抑制作用[11]。另外，粪肠球菌素ENTV主要依赖于真菌的生物信号即Fsr群体感应系统发挥抑制作用[12]。
3 细胞壁合成相关靶点
包括β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖在内的多糖是真菌细胞壁的重要组成成分。以抗真菌细胞壁的功能物质作用机制探究真菌细胞壁作用新靶点，旨在找到特异性高和副作用小的抗真菌药物(表1)。
3.1 影响细胞壁损伤的次生代谢产物
植物的天然劳森能在较低浓度水平上抑制尖孢霉增殖，作用机制除直接损伤真菌细胞壁外，还能改变膜通透性、激活氧化应激系统、诱导自噬相关基因(ATG1和ATG8)的上调表达等发生累积效应进而发挥抗真菌作用[13]。皂苷同样也能直接损伤细胞壁从而抑制白色念珠菌增殖，主要机制是使细胞壁产生不稳定性和减少酵母黏附[14]。
参与真菌繁殖、侵袭和免疫逃逸的分泌型天冬氨酸蛋白酶(secretory aspartic proteinase, SAP)是真菌重要毒力因子，可作为潜在的药物作用靶点。体外研究证实对从放线菌培养物中分离出来的胃抑霉素A进行P2和P3位点结构改造，所得产物对白色念珠菌SAP1、SAP3、SAP5和SAP6表现出较强的抑制力[15]。
3.2 影响细胞壁形成的相关基因突变
KTR基因缺失影响其编码的1,2-甘露糖基转移酶活性，导致细胞壁半乳甘露聚糖的缺失。另外SSDA基因突变影响几丁质合成酶的亚细胞定位继而影响细胞壁合成，这两种基因突变都能达到抑制真菌增殖的目的[16]。
3.3 影响细胞壁形成的相关信号通路
钙调磷酸酶调节的信号通路调节β-葡聚糖和几丁质的生物合成，在真菌细胞应激反应时影响细胞壁完整性。单独使用钙调磷酸酶抑制剂(环孢素A或他克莫司)对烟曲霉的增殖具有抑制作用[17]。因此阻断钙调磷酸酶信号通路被认为是一种新的抗深部真菌病策略。
4 抑制线粒体相关靶点
喹诺酮类化合物可引起线粒体膜电位的下降，诱导DNA损伤并使细胞周期停留在G2/M期，最终导致细胞凋亡。除此之外，喹诺酮类化合物还可通过影响氧化还原循环、蛋白质巯基的芳基化、诱导DNA链断裂及生物还原烷基化等机制导致真菌细胞产生毒性[18]。卤代水杨酰胺[N1-(3,5-二氯苯基)-5-氯-2-羟基苯甲酰胺]可通过破坏真菌线粒体蛋白转位发挥作用，而其类似物氯硝柳胺会导致真菌线粒体对细胞核出现逆行反应，因此其可用作抑制白色念珠菌侵袭肠上皮细胞的新型真菌抑制剂[19]。
小檗碱可与氟康唑联用产生协同抗耐药真菌作用，对耐药性白色念珠菌的协同抗菌效果尤其显著。其作用机制是通过增强三羧酸循环和抑制线粒体ATP合酶活性这两条途径使得内源性活性氧生成，导致耐药菌株的氧化损伤[20]。真菌产生的胶质毒素也能够抑制其他真菌病原体在人体内累积，相关机制与小檗碱产生的氧化损伤类似，在相应菌体中产生过氧化氢和超氧化物，导致真菌细胞内的单链和双链脱氧核糖核酸断裂[21]。
5 其他作用靶点
5.1 海藻糖代谢相关靶点
在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下，海藻糖汇集于真菌细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性，从而维持真菌的生命过程和生物学特征。白色念珠菌中海藻糖-6-磷酸合酶基因1(TPS1)的破坏会导致菌丝形成受损和感染性降低；而TPS2基因的破坏导致海藻糖-6-磷酸(T-6-P)的累积，高浓度的T-6-P具有细胞毒性，因此，海藻糖合成TPS1和TPS2基因可作为潜在的药物治疗靶点[22]。
表1 具有新靶点的抗真菌化合物
5.2 氨基酸与蛋白质代谢相关靶点
感染期间，真菌会呈现特有的氨基酸代谢过程，例如：缺乏CPCA(氨基酸饥饿时的转录激活剂)和AREA(当优选的氮源不可用时被激活的氮代谢阻遏剂)时会损害烟曲霉的毒力，使得氨基酸的代谢受阻，从而影响烟曲霉的毒力[23],因此特有的氨基酸代谢关键基因可作为潜在的药物靶点。
而真菌中的Bd1基因突变导致BET蛋白(bromodomain and extira-terminal)两个相关结构域的灭活，使得其在体外生存能力丧失和对小鼠致病毒力降低。二苯并噻二酮化合物就利用此特点发挥抑菌作用。这些发现使得高度选择性的BET蛋白抑制剂有望成为抗真菌治疗新策略，并确定Bd1基因可作为新作用靶点[24]。
5.3 针对金属离子稳态的相关靶点
真菌细胞内锌离子的螯合可导致其凋亡，如变形虫可能通过降低病原体锌的利用率来减少真菌细胞的增殖[25]。紫草素通过破坏白色念珠菌细胞膜的完整性，导致细胞内钙离子的流失进而引起菌体死亡[26]。二溴喹啉化合物也通过扰乱体内金属离子稳态而发挥抗真菌作用[27],因此有针对的调控菌体内金属离子失衡也可作为潜在的药物治疗靶点。
6 问题与展望
近年来，侵袭性真菌感染的高发病率和致死率已是当前面临的一大挑战， 探索潜在真菌特异性药物新靶点和开发新型抗真菌药物成为迫切需要。本文以药物作用新靶点为核心，在小分子抑制物和次生代谢产物等方面探究新型药物研发机制，以期寻求特异的治疗药物，但目前主要集中在酵母菌方面的研究，丝状真菌方面的研究相对滞后，且这些研究成果距离临床应用还有一段距离。
随着现代生物技术的发展，相关的后续研究可基于以下几个方面开展：1)深入研究新型抗真菌物质的作用机制，寻找相应的功能物质，为研发新型药物提供更加充分的理论依据；2)优化潜在安全、高效的新型药物的药效动力学及药代动力学，以满足未来抗真菌治疗的需求。3)将计算机辅助技术、基因组学及蛋白质组学技术等充分应用于新型药物的研发，这将有助于推动新一代高效、低副作用的抗真菌药物的研发和临床用药。
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