摘 要：目的 分析热射病患者外周血单个核细胞转录组测序生物信息学结果，寻找影响热射病预后的关键基因。方法 选取2019-06-01～2020-08-30空军军医大学附属西京医院急诊科收治的热射病患者，按照预后分为生存组和死亡组。随机数字法在两组中分别选取患者进行外周血单个核细胞转录组测序，生物信息学分析寻找差异基因；RT-PCR验证筛选出的差异基因在生存组和死亡组中的表达。结果 29例诊断为热射病患者入选，按照预后分为生存组和死亡组，其中生存组18例，死亡组11例。随机数字法选取6例生存患者和4例死亡患者，外周血单个核细胞进行转录组测序，两组患者有693个基因表达有明显差异，通过生物信息学分析筛选出趋化因子(C-C基元)配体5(CCL5)、基质金属蛋白酶8(MMP8)、MMP9基因可能与预后相关。将两组外周血单个核细胞的目标基因表达情况通过RT-PCR法表达检测，与生存组比较，死亡组MMP8基因(P=0.8955)和MMP9基因(P=0.0597)表达无明显变化，CCL5基因表达明显上升(t=7.056,P<0.05)。结论 CCL5基因可能是影响热射病预后的关键基因，需要进一步深入研究。
关键词：转录组测序 热射病预后 趋化因子(C-C基元)配体5(CCL5)
Identification of key genes for the heat stroke prognosis according to transcriptome sequencing
Zhang Ling-qin Xie Jian-gang Wang Qian-mei Xu Yun-yun Huang Yang
Department of Emergency,Xijing Hospital,Air Force Medical University;
Abstract：Objective To find key genes related to the heat stroke prognosis by transcriptome sequencing of peripheral blood mononuclear cells in the patients. Methods Heat stroke patients treated in emergency department of Xijing Hospital, Air Force Medical University from 2019-06-01 to 2020-08-30 were selected and divided into survival group and death group according to the prognosis. Peripheral blood mononuclear cells of patients were randomly selected to perform transcriptome sequencing. Bioinformatics analysis was applied to find differential genes; RT-PCR was performed to verify the expression of the differential genes screened in the two groups. Results A total of 29 patients were diagnosed with sepsis, which were divided into survival group(18 cases) and death group(11 cases) according to their prognosis. Six surviving cases and four dead cases were randomly selected to perform transcriptome sequencing, which showed that 693 genes were differentially expressed. By bioinformatics analysis, MMP8, MMP9 and chemokine(C-C motif) ligand 5(CCL5)were screened as target genes related to the prognosis; Compared with the survival group, the expression of MMP8(P=0.8955) and MMP9(P=0.0597) did not change significantly, and the expression of CCL5 gene was significantly increased in death group(t=7.056, P<0.05). Conclusions CCL5 may be a key gene affecting the prognosis of heat stroke, which need further research to verify.
Keyword：Transcriptome sequencing; Prognosis of heat stroke; Chemokine(C-C motif) ligand 5(CCL5);
热射病是自有记录以来一直困扰人类的疾病。由于全球气温不断升高，热射病的发生率和病死率明显增加，成为近年来广受关注的社会公共卫生突发事件[1]。热射病发病急且进展迅速，可导致多个器官发生系统性损伤，致死率、致残率特别高。据统计，在夏季热射病人群发病率为(17.6～26.5)/10万，住院患者病死率为14%～65%,而入住ICU的热射病患者病死率在60%以上[2]。热射病主要表现为中枢神经系统损伤、凝血障碍、肝肾功能衰竭、横纹肌溶解等临床现象[3]。目前临床上主要采取快速降温、纠正休克、改善凝血、脑保护及肝肾功能替代疗法等手段进行治疗[4]。研究[5]发现，热射病患者即使接受同样的治疗也可能预后不同，因而明晰影响热射病预后的要素，对热射病治疗可能有一定的指导意义。国内目前对影响热射病的相关研究主要集中在根据临床结果与预后相关性分析[6],国外有通过动物模型、细胞测序探索热射病发展的关键分子因素，提示免疫细胞分化及功能调控是主要原因[7]。本研究拟通过对不同预后热射病患者发病早期外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)转录组测序结果进行生物信息学数据分析，探究潜在的关键细胞通路和功能，筛选出影响热射病预后的重要基因，为热射病临床研究和治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2019-06-01～2020-08-30空军军医大学附属西京医院急诊科救治的热射病患者。纳入标准：按照中国热射病诊断与治疗专家共识[2],诊断为热射病；年龄18～60岁；入科时病程不足24 h。排除标准：有肿瘤、血液、免疫相关基础疾病；签字同意采集外周血进行医学研究。本研究已在西京医院伦理委员会备案并通过审批(审批号：KY20193106)。
1.2 分组和外周血单个核细胞转录组测序结果
入组患者发病24 h内收集外周血，分离PBMC并液氮冻存以长期保存。共29例患者诊断为热射病，按照预后分为生存组和死亡组，其中生存组18例，死亡组11例。随机数字法选取6例生存患者和4例死亡患者PBMC提取总RNA,送广州基迪奥公司进行热射病患者文库制备和测序分析。
1.3 差异基因筛选
将测序所得数据，进行数据过滤。过滤后的高质量数据通过Cufflinks程序求各个基因的相对表达量值，构建新的转录本。对新的转录本进行差异表达生物信息学分析。首先按照错误发现率(false discovery rate, FDR)与两组间表达量的比值(FC),对其取以2为底的对数(log2FC)的值来筛选差异基因，条件为： FDR<0.05且|log2FC|>1。求得差异基因之后，利用GO和KEGG Pathway数据库比对分析关键通路，结合基因表达热图，筛选出与预后关联最密切的基因。
1.4 关键基因RT-PCR验证
提取存活组18例，死亡组11例患者PBMC的总RNA,按照反转录试剂盒(北京gennstar公司)予以反转录。反应体系如下：反转录产物1 μL,前引物0.5 μL,后引物0.5 μL,SYBR Green(北京gennstar公司) 5 μL,无RNA酶去离子水3 μL。反应程序：95 ℃持续2 min, 模板变性；(95 ℃持续20 s, 58 ℃持续15 s)×40次循环。所得Ct值按照2-△△Ct公式处理，以GAPDH为内参，计算目的基因相对表达量。
1.5 统计学处理
测序数据采用FPKM方法进行样本基因表达量标准化，再使用edge软件DESeq2分析组间差异表达基因，明显表达差异筛选标准设定为：P值经过多重校验校正后的值<0.05。其他结果采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料进行正态性检验，符合正态分布的用均数±标准差(x¯±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组差异基因表达火山图
测序文库下机数据使用edgeR软件进行差异分析。结果显示，筛选出明显差异基因693个，与生存组比较死亡组表达上调基因326个，下调基因267个。见图1。
2.2 差异基因的GO功能注释分析
GO功能注释分析发现富集最为明显的前10个GOterm, 主要参与的是免疫细胞调控和免疫进程。包括：①细胞活化；②免疫系统过程；③免疫反应；④白细胞活化；⑤髓样白细胞活化；⑥中性粒细胞活化；⑦粒细胞活化；⑧白细胞脱粒；⑨中性粒细胞脱粒；⑩中性粒细胞活化参与免疫反应。见图2。
2.3 差异基因的KEGG通路富集分析
KEGG通路富集分析发现免疫相关通路占主导地位，这些基因主要参与了金黄色葡萄球菌感染、利什曼病、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、造血干细胞谱系、趋化因子信号通路、黏着斑、风湿性关节炎、扩张型心肌病PI3k-AKT信号通路、TNF信号通路等功能。见图3。
2.4 目的基因筛选
经过GO功能和KEGG富集解析，选取两组间表达差异前40的基因绘制热图，其中与免疫细胞功能相关的基因有趋化因子(C-C基元)配体5[chemokine(C-C motif)ligand 5, CCL5]、基质金属蛋白酶8(MMP8)、MMP9。通过热图发现，死亡组患者CCL5表达上调，MMP8、MMP9表达均下降。见图4。
2.5 目的基因在两组之间的表达情况
提取生存组18例、死亡组11例患者PBMC总RNA,RT-PCR检测目的基因表达。结果发现，与生存组比较，死亡组MMP8基因(P=0.8955)和MMP9基因(P=0.0597)无明显下降；与生存组比较，死亡组CCL5基因表达明显上调(t=7.056,P<0.05)。见图5。
3 讨论
热射病是最严重的热致疾病类型，起病突然，病情变化迅速、预后差、病死率很高。目前大多数研究集中于热射病治疗上面，对于影响热射病预后的关键因素缺少深入的追踪及解析，尤其是对于热射病患者生存与死亡不同预后之间的潜在机制有待进一步探究，热射病预后的决定因素是什么也尚无相关研究[8]。当前研究的热点集中于肝肾损伤、凝血异常、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)等相关生物标志物与预后的相关性分析[9],但是目前尚无明确结论，也无内在机制的进一步研究。因此，需要一种新的揭示热射病预后关键分子的方法进行与预后相关可能基因的筛查。
基因测序技术普及，大量基础研究通过基因测序揭示疾病预后关键基因[10]。由于PBMC容易获取，通过PBMC测序进行疾病研究已成为大多数科研单位的常规研究手段[11]。本研究通过收集热射病患者PBMC,构建测序数据库，结合生物信息学分析的方法，寻找热射病预后关键基因。通过初步筛查发现两组患者之间存在693个明显差异基因，与生存组比较，死亡组表达上调基因326个，下调基因267个。利用网络数据库比对GO功能和KEGG富集分析，发现差异基因集中最为明显的前10个GOterm, 主要参与的是免疫细胞调控和免疫进程。KEGG通路富集分析发现，免疫相关通路占主导地位，主要参与了趋化因子信号通路和炎症性疾病。因此，可以认为炎症调控相关基因和通路决定热射病患者预后。近年来的研究[12]提示，热射病相关性SIRS可能是导致热射病预后不良的重要因素。也有研究[13]通过动物模型测序揭示了炎症与氧化应激相关基因，认为巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞是决定热射病预后的决定因素。可见，炎症相关基因确实是参与热射病发展和预后调控的关键。
本研究通过生物信息学筛选和临床样本比对筛查发现CCL5在生存组患者中明显升高，CCL5基因上调可能与热射病预后不良有关。CCL5是重要的β趋化因子，具有N端CC结构域，在免疫系统细胞功能调控中发挥重要作用，例如CD4+和CD8+淋巴细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和NK细胞均可以被募集，参与机体免疫调控[14]。CCL5在肿瘤中研究较多，在癌细胞增殖、凋亡抗性、耐药性、迁移和侵袭中起到重要作用[15]。近年来发现[16],CCL5可以通过骨形态发生蛋白受体2(bone morphogenetic protein receptor 2, BMPR2)参与肺血管平滑肌功能调节。抑制CCL5表达可以减少巨噬细胞对T淋巴细胞的激活[17],可以减少成纤维细胞的炎症损伤，减轻幼儿急性肺损伤[18]。目前在热射病中尚未查阅到与热射病相关的CCL5研究，但是CCL5通过募集免疫细胞，调控机体炎症反应[19],通过调控血管平滑肌功能，调节机体血液循环系统，而这些方面的功能与热射病预后有明确的相关性，因此进一步深入的研究CCL5在热射病预后中的确切机制，对于揭示热射病预后不良的关键因素有一定作用。本研究样本量较小，存在一定不足。
综上所述，通过热射病患者PBMC测序，利用生物信息学分析，发现CCL5基因上调可能是热射病预后的关键，但需要进一步基础实验研究探索具体机制。
[1] Gauer R,Meyers BK.Heat-Related Illnesses[J].Am Fam Physician,2019,99(8):482-489.
[2] 全军热射病防治专家组，全军重症医学专业委员会.中国热射病诊断与治疗专家共识[J].解放军医学杂志，2019,44(3):181-196.
[3] Knapik JJ,Epstein Y.Exertional Heat Stroke:Pathophysiology,Epidemiology,Diagnosis,Treatment,and Prevention[J].J Spec Oper Med,2019,19(2):108-116.
[4] Liu SY,Wang Q,Lou YP,et al.Interpretations and comments for expert consensus on the diagnosis and treatment of heat stroke in China[J].Mil Med Res,2020,7(1):37.
[5] Hosokawa Y,Nagata T,Hasegawa M.Inconsistency in the Standard of Care-Toward Evidence-Based Management of Exertional Heat Stroke[J].Front Physiol,2019,10:108.
[6] 尹小雪，叶钢.劳力性热射病患者体内炎症介质表达与临床预后的相关研究[J].中国急救医学，2020,40(8):759-762.
[7] Niu B,Zhang T,Hu H,et al.Transcriptome Sequencing Reveals Astrocytes as a Therapeutic Target in Heat-Stroke[J].Neurosci Bull,2017,33(6):627-640.
[8] Laitano O,Leon LR,Roberts WO,et al.Controversies in exertional heat stroke diagnosis,prevention,and treatment[J].J Appl Physiol,2019,127(5):1338-1348.
[9] 肖文静，王武超，周倩云，等.热射病相关生物标志物研究进展[J].中国公共卫生，2021,37(2):381-384.
[10] Hermann S,Brandes F,Kirchner B,et al.Diagnostic potential of circulating cell-free microRNAs for community-acquired pneumonia and pneumonia-related sepsis[J].J Cell Mol Med,2020,24(20):12 054-12 064.
[11] Zwaag J,Beunders R,Warlé MC,et al.Remote ischaemic preconditioning does not modulate the systemic inflammatory response or renal tubular stress biomarkers after endotoxaemia in healthy human volunteers:a single-centre,mechanistic,randomised controlled trial[J].Br J Anaesth,2019,123(2):177-185.
[12] 于超平，李俊杰，尹文.热射病相关SIRS研究进展[J].临床急诊杂志，2021,22(4):287-291.
[13] Liu Z,Chen J,Hu L,et al.Expression profiles of genes associated with inflammatory responses and oxidative stress in lung after heat stroke[J].Biosci Rep,2020,40(6):BSR20 192 048.
[14] Bohmwald K,Gálvez NMS,Canedo-Marroquín G,et al.Contribution of Cytokines to Tissue Damage During Human Respiratory Syncytial Virus Infection[J].Front Immunol,2019,10:452.
[15] Aldinucci D,Borghese C,Casagrande N.The CCL5/CCR5 Axis in Cancer Progression[J].Cancers (Basel),2020,12(7):1765.
[16] Nie X,Tan J,Dai Y,et al.CCL5 deficiency rescues pulmonary vascular dysfunction,and reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent BMPR2 activation[J].J Mol Cell Cardiol,2018,116:41-56.
[17] Alain T,Jaramillo M.Translational repression of Ccl5 and Cxcl10 by 4E-BP1 and 4E-BP2 restrains the ability of mouse macrophages to induce migration of activated T cells[J].Eur J Immunol,2019,49(8):1200-1212.
[18] Bai D,Han A,Cong S.The effect of down-regulation of CCL5 on lipopolysaccharide-induced WI-38 fibroblast injury:a potential role for infantile pneumonia[J].Iran J Basic Med Sci,2018,21(5):449-454.
[19] Dineen SM,Ward JA,Leon LR.Prior viral illness increases heat stroke severity in mice[J].Exp Physiol,2021,106(1):244-257.