摘 要：目的：探讨三重实时荧光PCR法在急性胃肠炎聚集性疫情中快速检测GⅠ/GⅡ型诺如病毒和A组轮状病毒的应用。方法：采集2020年11月12日一起学校急性胃肠炎聚集性疫情中的疑似病例、临床诊断病例、密切接触者标本及环境标本共373份，用三重实时荧光RT-PCR法同时检测诺如病毒(基因组GⅠ/GⅡ)和A组轮状病毒核酸，根据不同病毒核酸的检出率分析该疫情的主要病原体，分析病原体在感染者中年龄的分布影响。结果：373份标本中检出诺如病毒(基因组GⅠ/GⅡ)144份，检出率38.61%；检出A组轮状病毒2份，检出率0.54%；检出诺如病毒和A组轮状病毒混合感染6份，检出率1.61%。不同性别间诺如病毒感染阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同职业间诺如病毒感染阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。>45岁组人群诺如病毒感染阳性率最高，26～35岁组阳性率最低，不同年龄组人群阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：诺如病毒可能是导致本次疫情的主要病原体，同时存在诺如病毒和A组轮状病毒混合感染的情况，三重实时荧光PCR法同时检测多种病毒为疫情快速处置提供了实验室依据。
关键词：三重实时荧光PCR;急性胃肠炎聚集性疫情;诺如病毒;轮状病毒;
急性胃肠炎聚集性疫情易发生在学校、托幼机构、工厂及工地等人群聚集场所，起病急、传染性强、覆盖面广，导致严重的公共卫生问题。由于其致病病原体众多，有细菌、病毒及寄生虫等，而临床表现、常规检查及流行病学调查情况相似，给疫情的研判带来阻碍[1,2]。在一线医疗卫生机构，特别是基层疾控中心，参与调查处置相关疫情的工作较多，因此，需要尽快建立一种快速简单的实验室检测方法，为疾病预防控制工作提供实验室技术支持。造成急性胃肠炎疫情暴发的主要因素是诺如病毒(NV),NV是引起人类急性非细菌性胃肠炎的重要病原体之一。NV感染性腹泻患者、隐性感染者及病原携带者均可作为本病的传染源，急性胃肠炎潜伏期最短12 h，平均24～48 h，可以通过食物、水、生活接触或吸入悬浮在空气张的气溶胶传播，传播速度极快，极易在短时间内造成大规模爆发流行。本次探讨应用三重实时荧光PCR法，对373份人员及环境标本同时进行GⅠ型、GⅡ型NV和A组轮状病毒感染情况检测，现报告如下。
资料与方法
采集2020年11月某地一起学校急性胃肠炎聚集性疫情的疑似病例、临床诊断病例及密切接触者肛拭子、粪便及呕吐物标本258份，学校食堂餐具、教室、寝室及卫生间等环境物表拭子标本115份。
方法：肛拭子标本采用肛拭法采集，将专用采样拭子用生理盐水润湿后，插入肛门2～3 cm，轻轻旋转擦取直肠表面，需注意肛拭子上应有可见的粪便；粪便或呕吐物标本每份取>5 g或5 m L，直接放入无菌干燥容器内；环境物表拭子采用涂抹法采集，用无菌拭子在病毒保存液里蘸湿，用力反复涂抹待采表面(最大面积100 cm2)，所采标本均低温保存尽快送至实验室。标本处理：肛拭子、粪便、呕吐物及环境物表标本分别用旋涡振荡器混匀后直接取200μL混悬液参与提取。核酸提取使用杭州博日NPA-32P核酸提取纯化仪及配套的病毒DNA/RNA磁珠法提取试剂盒(BSC57M1B)。将室温放置96孔试剂板颠倒3次，去除塑封膜后在96孔板离心机中短暂离心，避免挂液。撕去96孔试剂板上的铝箔膜，确认板子方向(磁珠在第6/12列)。在第1列及第7列中加入200μL样品，避免交叉污染。将96孔板放入核酸提取纯化仪中，装上磁棒护套，按裂解-吸磁珠-结合-洗涤3次-洗脱-弃磁珠的程序进行自动化提取实验。RT-PCR扩增反应体系及条件：检测试剂使用北京卓诚惠生的A组轮状病毒/诺如病毒GⅠ/诺如病毒GⅡ/三重实时荧光PCR检测试剂盒，严格按照试剂盒说明书配制扩增体系。1个反应体系含无核酸酶水2μL、2×核酸扩增反应液10μL、20×反转录酶1μL、10×引物探针反应液2μL，将上述反应液混匀离心后，按照每管15μL分装于PCR管中，最后加入提取的5μL的RNA样品，构成20μL的总反应体系。阳性对照体系加入相应模板5μL。PCR循环条件设置为45℃，20 min,1个循环；95℃，5 min,1个循环；95℃，15 s,55℃，45 s,45个循环。在55℃延伸时收集荧光信号。报告集团分别设置为FAM、VIC及CY5，分别对应A组轮状病毒、GⅡ型诺如病毒及GⅠ型诺如病毒的核酸检测。
结果判定与质控：检测仪器为Roche罗氏Light Cycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪。阈值设定原则为以刚好超过正常阴性对照的荧光信号最高点为阈值线。空白对照和阴性对照无扩增曲线，且阳性对照在三个检测通道均有S型扩增曲线，实验成立，否则判为实验无效。若标本有S型扩增且Ct值≤35，根据检测目标对应的荧光通道进行判定。若有S型扩增，且Ct值35～40，判定为不确定标本，需重新提取核酸后进行检测；若复检的标本有S型扩增，且Ct值<40，根据相应荧光通道检测的目标病毒进行判定，否则判定为阴性。若标本无明显S型扩增曲线，但报告有Ct值，判定为阴性。
统计学方法：采用spss 20.0统计学分析系统展开数据处理；计数资料用[n(%)]表示，采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
检出病毒核酸分布情况：在检测的373份标本中，共检出NV阳性标本144份，分别是肛拭子、粪便及呕吐物阳性标本共131份，环境物表拭子阳性标本13份，检出率为38.61%；检出A组轮状病毒2份，均为人员标本，检出率0.54%；检出NV和A组轮状病毒混合感染检出6份，检出率1.61%，均为人员标本，其中A组轮状病毒和NV(基因组GⅠ/GⅡ)1份，A组轮状病毒和GⅠ型NV为2份，A组轮状病毒和GⅡ型NV为3份。144份NV阳性标本中，检出GⅡ型NV为111份，构成比77.08%,GI型NV为22份，构成比15.28%；检出NV(基因组GⅠ/GⅡ)11份，构成比7.64%。检测结果显示，A组轮状病毒、NV的S型扩增曲线典型，阳性对照在三个通道均有S型扩增曲线，空白和阴性对照没有荧光信号产生，表明本试验结果准确有效。
NV感染者性别分布情况：不同性别间NV感染阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
表1 NV感染者性别分布情况[n(%)]
NV感染者职业分布情况：不同职业间NV感染阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。
表2 NV感染者职业分布情况[n(%)]
不同年龄组NV阳性率比较：>45岁组人群诺如病毒感染阳性率最高，26～35岁组阳性率最低，不同年龄组人群阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。
表3 不同年龄组NV阳性率比较[n(%)]
讨论
全球急性胃肠炎的散发病例和暴发疫情的主要致病原是NV，该病毒由于感染剂量低、抵抗力强、传播速度快，极易造成大规模群体感染事件，NV不仅可引起成人、儿童胃肠炎散发病例，还常在医院、养老院、学校及托幼机构等场所引起暴发。NV传播途径包括人传人、经食物和经水传播。人传人可通过粪口途径(包括摄入粪便或呕吐物产生的气溶胶)或间接接触被排泄物污染的环境而传播。食源性传播是通过食用被NV污染的食物进行传播，污染环节可出现在感染NV的餐饮从业人员在备餐和供餐中污染食物，也可出现食物在生产、运输和分发过程中被含有NV的人类排泄物或其他物质所污染，例如食物暴露引起的点源暴发常会导致在一个机构或社区内出现续发的人与人之间传播。2013年以来我国NV感染导致的暴发疫情大幅增加，主要发生在学校、托幼机构和医疗机构等人群聚集场所[3]。本探讨的聚集性疫情发生在学校，通过检测各类标本373份，检出人员标本NV阳性131份，检出率35.12%，高于部分地区的检出率[4,5]；检出人员标本A组轮状病毒阳性2份，A组轮状病毒检出率为0.54%，明显低于NV检出率；检出A组轮状病毒和NV均为阳性标本6份，检出率为1.61%。我国国内多地监测结果也显示，GⅡ型是NV感染的主要基因型。丽水、宁波、沈阳通过对NV腹泻病例分析，GⅡ型的检出率分别为92.12%、93.4%、86.96%，本次探讨的疫情中仍以GⅡ型(77.08%)感染为主，GⅠ型占15.28%，与上述地区监测结果一致[6]。该疫情中NV感染病例性别分布比较，男性阳性率51.55%，女性阳性率50.31%，不同性别感染阳性率比较，差异无统计学意义，与相关文献结果一致[7]。也有较多文献支持NV感染的不同年龄比较，差异有统计学意义[8]。经过对本起疫情的流行病学调查，分析传染源为该学校食堂的一名54岁从业人员，>45岁组人群主要是学校食堂及其他后勤部门工作人员，与他有密切接触，因此，阳性率最高；16～25岁组人群以住校学生为主，多在该食堂就餐，造成阳性率也较高；26～35岁组人群多为年轻的教职工，该组人群在外面餐馆就餐或点外卖人数较多，在学校食堂进餐人数与次数均较少，因此，被传染的机会降低，阳性率在各年龄组中最低。
该探讨采用三重实时荧光PCR方法，运用荧光标志物和自动化仪器，依据每一个反应体系均含有轮状病毒、GⅠ型、GⅡ型NV基因保守序列设计的特异性引物和探针，在同一反应管内实现了对三种病毒的同时检测和分型，并在几个小时内完成检测，缩短了检测时间和流程，提高了检测效率。
综上所述，NV可能是导致本次疫情的主要病原体，同时存在NV和A组轮状病毒混合感染的情况，三重实时荧光PCR法同时检测多种病毒为疫情快速处置提供了实验室依据。
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